Abstract Cancer cells are defined by their ability to invade through the basement membrane, a critical step during metastasis. While increased secretion of proteases, which facilitates degradation of the basement membrane, and alterations in the cytoskeletal architecture of cancer cells have been previously studied, the contribution of the mechanical properties of cells in invasion is unclear. Here, we applied a magnetic tweezer system to establish that stiffness of patient tumor cells and cancer cell lines inversely correlates with migration and invasion through three-dimensional basement membranes, a correlation known as a power law. We found that cancer cells with the highest migratory and invasive potential are five times less stiff than cells with the lowest migration and invasion potential. Moreover, decreasing cell stiffness by pharmacologic inhibition of myosin II increases invasiveness, whereas increasing cell stiffness by restoring expression of the metastasis suppressor TβRIII/betaglycan decreases invasiveness. These findings are the first demonstration of the power-law relation between the stiffness and the invasiveness of cancer cells and show that mechanical phenotypes can be used to grade the metastatic potential of cell populations with the potential for single cell grading. The measurement of a mechanical phenotype, taking minutes rather than hours needed for invasion assays, is promising as a quantitative diagnostic method and as a discovery tool for therapeutics. By showing that altering stiffness predictably alters invasiveness, our results indicate that pathways regulating these mechanical phenotypes are novel targets for molecular therapy of cancer. Cancer Res; 71(15); 5075–80. ©2011 AACR.

Mechanical force causes stiffening, or reinforcement, of integrin-based cellular adhesions. This reinforcement is shown to be mediated by the recruitment of the LARG and GEF-H1 guanine nucleotide exchange factors, which activate distinct signalling pathways in response to integrin stimulation. How individual cells respond to mechanical forces is of considerable interest to biologists as force affects many aspects of cell behaviour1. The application of force on integrins triggers cytoskeletal rearrangements and growth of the associated adhesion complex, resulting in increased cellular stiffness2,3, also known as reinforcement4. Although RhoA has been shown to play a role during reinforcement3, the molecular mechanisms that regulate its activity are unknown. By combining biochemical and biophysical approaches, we identified two guanine nucleotide exchange factors (GEFs), LARG and GEF-H1, as key molecules that regulate the cellular adaptation to force. We show that stimulation of integrins with tensional force triggers activation of these two GEFs and their recruitment to adhesion complexes. Surprisingly, activation of LARG and GEF-H1 involves distinct signalling pathways. Our results reveal that LARG is activated by the Src family tyrosine kinase Fyn, whereas GEF-H1 catalytic activity is enhanced by ERK downstream of a signalling cascade that includes FAK and Ras.

Polarized fluorescence microscopy is a valuable tool for measuring molecular orientations, but techniques for recovering three-dimensional orientations and positions of fluorescent ensembles are limited. We report a polarized dual-view light-sheet system for determining the three-dimensional orientations and diffraction-limited positions of ensembles of fluorescent dipoles that label biological structures, and we share a set of visualization, histogram, and profiling tools for interpreting these positions and orientations. We model our samples, their excitation, and their detection using coarse-grained representations we call orientation distribution functions (ODFs). We apply ODFs to create physics-informed models of image formation with spatio-angular point-spread and transfer functions. We use theory and experiment to conclude that light-sheet tilting is a necessary part of our design for recovering all three-dimensional orientations. We use our system to extend known two-dimensional results to three dimensions in FM1-43-labelled giant unilamellar vesicles, fast-scarlet-labelled cellulose in xylem cells, and phalloidin-labelled actin in U2OS cells. Additionally, we observe phalloidin-labelled actin in mouse fibroblasts grown on grids of labelled nanowires and identify correlations between local actin alignment and global cell-scale orientation, indicating cellular coordination across length scales.

Light microscopy is a powerful single-cell technique that allows for quantitative spatial information at subcellular resolution. However, unlike flow cytometry and single-cell sequencing techniques, microscopy has issues achieving high-quality population-wide sample characterization while maintaining high resolution. Here, we present a general framework, data-driven microscopy (DDM), that uses population-wide cell characterization to enable data-driven high-fidelity imaging of relevant phenotypes. DDM combines data-independent and data-dependent steps to synergistically enhance data acquired using different imaging modalities. As proof-of-concept, we apply DDM with plugins for improved high-content screening and live adaptive microscopy. DDM also allows for easy correlative imaging in other systems with a plugin that uses the spatial relationship of the sample population for automated registration. We believe DDM will be a valuable approach for reducing human bias, increasing reproducibility, and placing singlecell characteristics in the context of the sample population when interpreting microscopy data, leading to an overall increase in data fidelity.

Integrins are transmembrane receptors that, upon activation, bind extracellular matrix (ECM) or cell surface ligands and link them to the actin cytoskeleton to mediate cell adhesion and migration1,2. One model for the structural transitions mediating integrin activation termed ′the cytoskeletal force hypothesis′ posits that force transmitted from the cytoskeleton to ligand-bound integrins acts as an allosteric stabilizer of the extended-open, high-affinity state3. Since cytoskeletal forces in migrating cells are generated by centripetal ′retrograde flow′ of F-actin from the cell leading edge, where integrin-based adhesions are initiated4,5, this model predicts that F-actin flow should align and orient activated, ligand-bound integrins in integrin-based adhesions. Here, polarization-sensitive fluorescence microscopy of GFP-αβV3 integrin chimeras in migrating fibroblasts shows that integrins are aligned with respect to the axis of FAs and the direction of F-actin flow, and this alignment requires binding immobilized ligand and talin-mediated linkage to a flowing cytoskeleton. Polarization imaging and Rosetta modelling of chimeras engineered to orient GFP differentially with respect to the integrin headpiece suggest that ligand-bound αVβ3 integrin may be markedly tilted by the force of F-actin flow. These results show that actin cytoskeletal forces actively sculpt an anisotropic molecular scaffold in FAs that may underlie the ability of cells to sense directional ECM and physical cues.

Abstract Fibroblasts are contractile adherent cells that maintain tissue homeostasis by sensing a wide array of changes in the extracellular matrix (ECM) and in response, regulate the physical and compositional properties of the ECM. These diverse cues are sensed by focal adhesions (FAs) that differentially couple changes in the ECM to the actomyosin machinery via modulation of integrin activation and the resultant recruitment of several proteins. One such protein is Septin-7 (Sept-7) that belongs to the septin family and has been found in FA proteomics and interactome studies. Sept-7 however, is not considered an FA protein and is thought to regulate and be regulated by actin outside of FAs. To reconcile these differences, here we used total internal reflection microscopy to image Sept-7 localization and dynamics at the cell-ECM interface and found that that ECM-mediated integrin activation in fibroblasts regulates the formation of spatially distinct higher order Sept-7 structures at FA subpopulations. In and around FAs located in the perinuclear regions of the cell, ECM binding resulted in the formation and stabilization of Sept-7 bundles while ECM binding and complete integrin activation promoted the growth of FA-like elongated Sept-7 structures that dynamically associated with the core of peripheral FAs. Functionally, peripheral Sept-7 structures promoted the elongation of peripheral FAs while perinuclear Sept-7 bundles were critical in regulating the maturation and stabilization of perinuclear FAs. Due to this coupling between the ECM, integrin activation and regulation of Sept-7 structures, we found that Sept-7 is required for a wide range of ECM sensing functions in fibroblasts including modulating sensitivity to changes in ECM stiffness and density and in contributing to the cells ability to remodel the ECM. Collectively, our results show that Sept-7 is an FA protein that gets recruited and assembled in diverse higher order structures in an ECM dependent manner to differentially regulate FA subpopulations and promote mechanosensing and ECM remodelling functions in fibroblasts.

Integrin αβ heterodimer cell surface receptors mediate adhesive interactions that provide traction for cell migration. Here, we test whether the integrin head, known from crystal structures, adopts a specific orientation dictated by the direction of actin flow on the surface of migrating cells. We insert GFP into the rigid head of the full integrin, model with Rosetta the orientation of GFP and its transition dipole relative to the integrin, and measure orientation with fluorescence polarization microscopy. Dependent on coupling to the cytoskeleton, integrins orient in the same direction as retrograde actin flow with their cytoskeleton-binding β-subunits tilted by applied force. The measurements demonstrate that intracellular forces can orient cell surface integrins and support a molecular model of integrin activation by cytoskeletal force. We have developed a method that places atomic, ~Å structures of cell surface receptors in the context of functional, cellular length-scale, ~μm measurements and shows that rotation and tilt of cell surface receptors relative to the membrane plane can be restrained by interactions with other cellular components.

Abstract Specificity of cellular responses to distinct cues from the extracellular matrix (ECM) requires precise and sensitive decoding of information from the cell surface. However, how known mechanisms of mechanosensing such as force dependent catch bonds and conformational changes in focal adhesion (FA) proteins can confer this sensitivity is not known. Using a combination of polarization microscopy and computational modeling, here we identify regulation of orientational order or molecular co-alignment of FA proteins as a mechanism able to precisely tune cell sensitivity to the ECM. We find that αV integrins and F-actin in FAs show changes in orientational order in an ECM-mediated integrin activation dependent manner. This magnitude of orientational order is sensitive to changes in ECM density but independent of myosin-II activity though actomyosin contractility can further fine-tune it. A molecular clutch model for integrin binding ECM ligands demonstrates that orientational order of integrin-ECM binding and catch bonds tune cellular sensitivity to ECM density. This mechanism is also able to decouple ECM density changes from changes in ECM stiffness thus also contributing to specificity. Taken together, our results suggest relative geometric organization of FA components as an important regulator of mechanotransduction.