Abstract Genetic variation segregates as linked sets of variants, or haplotypes. Haplotypes and linkage are central to genetics and underpin virtually all genetic and selection analysis. And yet, genomic data often lack haplotype information, due to constraints in sequencing technologies. Here we present “haplotagging”, a simple, low-cost linked-read sequencing technique that allows sequencing of hundreds of individuals while retaining linkage information. We apply haplotagging to construct megabase-size haplotypes for over 600 individual butterflies ( Heliconius erato and H. melpomene ), which form overlapping hybrid zones across an elevational gradient in Ecuador. Haplotagging identifies loci controlling distinctive high- and lowland wing color patterns. Divergent haplotypes are found at the same major loci in both species, while chromosome rearrangements show no parallelism. Remarkably, in both species the geographic clines for the major wing pattern loci are displaced by 18 km, leading to the rise of a novel hybrid morph in the centre of the hybrid zone. We propose that shared warning signalling (Müllerian mimicry) may couple the cline shifts seen in both species, and facilitate the parallel co-emergence of a novel hybrid morph in both co-mimetic species. Our results show the power of efficient haplotyping methods when combined with large-scale sequencing data from natural populations. One-sentence summary Haplotagging, a novel linked-read sequencing technique that enables whole genome haplotyping in large populations, reveals the formation of a novel hybrid race in parallel hybrid zones of two co-mimicking Heliconius butterfly species through strikingly parallel divergences in their genomes.

Abstract Repeated evolution can provide insight into the mechanisms that facilitate adaptation to novel or changing environments. Here we study adaptation to high altitude in two divergent tropical butterflies, H. erato and H. melpomene , which have repeatedly and independently adapted to high elevations on either side of the Andean mountains. We sequenced 518 whole genomes from elevational transects and found many regions under selection at high altitude, with repeated genetic differentiation across multiple replicates, including allopatric comparisons. In contrast, there is little ‘molecular parallelism’ between H. erato and H. melpomene . With a further 85 whole genomes of five close relatives, we find that a large proportion divergent regions have arisen from standing variation and putative adaptive introgression from high-altitude specialist species. Taken together our study supports a key role of standing genetic variation and gene flow from pre-adapted species in promoting parallel genetic local adaptation to the environment.

Abstract Complete genome sequencing has identified millions of DNA changes that differ between humans and chimpanzees. Although a subset of these changes likely underlies important phenotypic differences between humans and chimpanzees, it is currently difficult to distinguish causal from incidental changes and to map specific phenotypes to particular genome locations. To facilitate further genetic study of human-chimpanzee divergence, we have generated human and chimpanzee auto-tetraploids and allo-tetraploids by fusing induced pluripotent stem cells (iPSCs) of each species. The resulting tetraploid iPSCs can be stably maintained and retain the ability to differentiate along ectoderm, mesoderm, and endoderm lineages. RNA sequencing identifies thousands of genes whose expression differs between humans and chimpanzees when assessed in single-species diploid or auto-tetraploid iPSCs. Analysis of gene expression patterns in inter-specific allo-tetraploid iPSCs shows that human-chimpanzee expression differences arise from substantial contributions of both cis -acting changes linked to the genes themselves, and trans -acting changes elsewhere in the genome. To enable further genetic mapping of species differences, we tested chemical treatments for stimulating genome-wide mitotic recombination between human and chimpanzee chromosomes, and CRISPR methods for inducing species-specific changes on particular chromosomes in allo-tetraploid cells. We successfully generated derivative cells with nested deletions or inter-specific recombination on the X chromosome. These studies identify a long distance cis -regulatory domain of the Fragile X-associated gene ( FMR1 ), confirm an important role for the X chromosome in trans-regulation of other expression differences, and illustrate the potential of this system for more detailed mapping of the molecular basis of human and chimpanzee evolution. Significance Statement Comparative studies of humans and chimpanzees have revealed many anatomical, physiological, behavioral, and molecular differences. However, it has been challenging to map these differences to particular chromosome regions. Here, we develop a genetic approach in fused stem cell lines that makes it possible to map human-chimpanzee molecular and cellular differences to specific regions of the genome. We illustrate this approach by mapping chromosome regions responsible for species-specific gene expression differences in fused tetraploid cells. This approach is general, and could be used in the future to map the genomic changes that control many other humanchimpanzee differences in various cell types or organoids in vitro .

Evolutionary studies are often limited by missing data that are critical to understanding the history of selection. Selection experiments, which reproduce rapid evolution under controlled conditions, are excellent tools to study how genomes evolve under strong selection. Here we present a genomic dissection of the Longshanks selection experiment, in which mice were selectively bred over 20 generations for longer tibiae relative to body mass, resulting in 13% longer tibiae in two replicate lines. We synthesized evolutionary theory, genome sequences and molecular genetics to understand the selection response and found that it involved both polygenic adaptation and discrete loci of major effect, with the strongest loci likely to be selected in parallel between replicates. We show that selection may favor de-repression of bone growth through inactivation of two limb enhancers of an inhibitor, Nkx3-2. Our integrative genomic analyses thus show that it is possible to connect individual base-pair changes to the overall selection response.

Discovering the genetic changes underlying species differences is a central goal in evolutionary genetics. However, hybrid crosses between species in mammals often suffer from hybrid sterility, greatly complicating genetic dissection of trait variation. Here we describe a simple, robust and transgene-free technique to make “in vitro crosses” in hybrid mouse embryonic stem cells by inducing random mitotic crossovers with the drug ML216, which inhibits Bloom syndrome (BLM). Starting with an interspecific hybrid (between Mus musculus and Mus spretus) embryonic stem cell line spanning 1.5 million years of divergence, we demonstrate the feasibility of mapping enzymatic differences across species within weeks and the possibility of re-deriving whole mice. Our work shows how in vitro crosses can overcome major bottlenecks like hybrid sterility in traditional mouse breeding to address fundamental questions in evolutionary biology.

Carotenoid pigmentation produces most of the yellow and red coloration of birds and other vertebrates, but our understanding of the genetic architecture of carotenoid ornamentation is largely limited to studies of novel color variants observed in captively bred populations. The complexity of carotenoid-based color evolution in nature remains poorly characterized. Here, we examine the long-tailed finch Poephila acuticauda, an Australian songbird with two hybridizing subspecies that differ in bill coloration: yellow in western subspecies acuticauda and red in eastern subspecies hecki. We characterize the carotenoid composition of each subspecies and find that yellow bills can be explained by the loss of C(4)-oxidation, thus blocking yellow dietary pigments from being metabolized to red. Combining linked-read genomic sequencing and reflectance spectrophotometry measurements of bill color collected from wild-sampled finches and laboratory crosses, we identify four loci that together explain 53% of variance in this trait. The two loci of largest effect contain the genes CYP2J19, an essential enzyme for the ketolation via C(4)-oxidation of dietary carotenoids, and TTC39B, an enhancer of ketocarotenoid production. Evolutionary genealogy reconstruction indicates that the red-billed phenotype is ancestral and that yellow alleles at both CYP2J19 and TTC39B arose and fixed in acuticauda approximately 100 kya. Yellow alleles then introgressed into hecki less than 5 kya. Across all four loci, acuticauda derived variants show evidence of selective sweeps, implying that yellow bill coloration has been favored by natural selection. Our study suggests that the frequent adaptive evolutionary transitions between red and yellow ornamentation in nature can have a simple genetic basis.

Abstract Chromosomal inversions contribute to adaptive speciation by linking co-adapted alleles. Querying 1,375 genomes of the species-rich Malawi cichlid fish radiation, we discovered five large inversions segregating in the benthic subradiation that each suppress recombination over more than half a chromosome. Two inversions were transferred from deepwater pelagic Diplotaxodon via admixture, while the others established early in the deep benthics . Introgression of haplotypes from lineages inside and outside the Malawi radiation coincided with bursts of species diversification. Inversions show evidence for transient sex linkage and a striking excess of protein changing substitutions pointing towards selection on sensory, behavioural and reproductive genes. We conclude that repeated interplay between depth adaptation and sex-specific selection on large inversions has been central to the evolution of this iconic system.

Background Mice of the genus Apodemus are one the most common mammals in the Palaearctic region. Despite their broad range and long history of ecological observations, there are no whole-genome data available for Apodemus , hindering our ability to further exploit the genus in evolutionary and ecological genomics context.Results Here we present results from the double-digest restriction site-associated DNA sequencing (ddRAD-seq) on 72 individuals of A. flavicollis and 10 A. sylvaticus from four populations, sampled across 500 km distance in northern Poland. Our data present clear genetic divergence of the two species, with average p-distance, based on 21377 common loci, of 1.51% and a mutation rate of 0.0011 - 0.0019 substitutions per site per million years. We provide a catalogue of 117 highly divergent loci that enable genetic differentiation of the two species in Poland and to a large degree of 20 unrelated samples from several European countries and Tunisia. We also show evidence of admixture between the three A. flavicollis populations but demonstrate that they have negligible average population structure, with largest pairwise FST < 0.086.Conclusion Our study demonstrates the feasibility of ddRAD-seq in Apodemus and provides the first insights into the population genomics of the species.* mtDNA : mitochondrial DNA ddRAD-seq : double-digest restriction site-associated DNA sequencing SNP : single nucleotide polymorphism MAF : minor allele frequency HWE : Hardy-Weinberg equilibrium PCA : principal component analysis Fst : fixation index VCF : variant call format

The adaptive immune system's efficacy relies on the diversity of T cell receptors and the ability to distinguish between self and foreign antigens. Analysis of the paired heterodimeric αβ-TCR chains of individual T cells requires single-cell resolution, but existing single-cell approaches offer limited coverage of the vast TCR repertoire diversity. Here we introduce CITR-seq, a novel, instrument-free, high-throughput method for single-cell TCR sequencing with >88% αβ-TCR pairing precision. We analyzed the TCR repertoires of CD8+ T cells originated from 32 inbred mice using CITR-seq, comprising four evolutionary divergent sister species and their F1 hybrids. Overall, we identified more than 5 million confidently paired TCRs. We found that V(D)J gene usage patterns are highly specific to the genotype and that Vβ-gene usage is strongly impacted by thymic selection. Using F1 hybrids, we show that differences in gene segment usage across species are likely caused by cis -acting factors prior to thymic selection, which imposed strong allelic biases. At the greatest divergence, this led to increased rates of TCR depletion through rejection of particular Vβ-genes. TCR repertoire overlap analysis across all mice revealed that sharing of identical paired CDR3 amino acid motifs is four times more frequent than predicted by random pairing of TCRα and TCRβ chains, with significantly increased sharing rates among related individuals. Collectively, we show that beyond the stochastic nature of TCR repertoire generation, genetic factors contribute significantly to the shape of an individual's repertoire.

Understanding the production, response, and genetics of signals used in mate choice can inform our understanding of the evolution of both intraspecific mate choice and reproductive isolation. Sex pheromones are important for courtship and mate choice in many insects, but we know relatively little of their role in butterflies. The butterfly Heliconius melpomene uses a complex blend of wing androconial compounds during courtship. Electroantennography in H. melpomene and its close relative H. cydno showed that responses to androconial extracts were not species-specific. Females of both species responded equally strongly to extracts of both species, suggesting conservation of peripheral nervous system elements across the two species. Individual blend components provoked little to no response, with the exception of octadecanal, a major component of the H. melpomene blend. Supplementing octadecanal on the wings of octadecanal-rich H. melpomene males led to an increase in the time until mating, demonstrating the bioactivity of octadecanal in Heliconius. Using quantitative trait locus (QTL) mapping, we identified a single locus on chromosome 20 responsible for 41% of the parental species’ difference in octadecanal production. This QTL does not overlap with any of the major wing color or mate choice loci, nor does it overlap with known regions of elevated or reduced F ST. A set of 16 candidate fatty acid biosynthesis genes lies underneath the QTL. Pheromones in Heliconius carry information relevant for mate choice and are under simple genetic control, suggesting they could be important during speciation.