ABSTRACT The vertebrate retina is a complex multicellular tissue made up of distinct neuron types and glia, arranged in a stereotypic layered organisation to facilitate vision. Understanding how these cell types come together to form precise circuits during development requires the ability to simultaneously discriminate between multiple cell types and their spatial position in the same tissue. Currently, we have a limited capacity to resolve all constitutive cell types and their relationships to one another due to our limited ability to combine multiple cellular markers. To extend this capacity, we have adapted a highly multiplexed immunohistochemistry technique known as Iterative Bleaching Extends Multiplexity (IBEX) and applied it to the development of the zebrafish ( Danio rerio) retina. IBEX allows for multiple rounds of cellular labelling to be performed, before imaging and integration of data, resulting in the ability to visualise multiple markers on the same tissue. We have optimised IBEX in zebrafish using fluorescent micro-conjugation of known antibody markers to label the complete retina with up to 11 cell-specific antibodies. We have further adapted the IBEX technique to be compatible with fluorescent transgenic reporter lines, in situ hybridisation chain reaction (HCR), and wholemount immunohistochemistry (WMIHC). We then took advantage of IBEX to explore the multicellular relationships in the developing retina between glial cells and neurons and photoreceptor subtypes. Finally, we tested IBEX on retinas from the emerging ageing model, the killifish ( Nothobranchius furzeri) , and developmental model, the African clawed frog ( Xenopus laevis), demonstrating the usefulness of the technique across multiple species. The techniques described here can be applied to any tissue in any organism where antibodies are readily available to efficiently explore cellular relationships in the context of development, ageing or disease.

To understand the multicellular composition of tissues, and how it is altered during development, ageing and/or disease, we must visualise the complete cellular landscape. Currently, this is hindered by our limited ability to combine multiple cellular markers. To overcome this, we adapted a highly multiplexed immunofluorescence (IF) technique called Iterative Bleaching Extends Multiplexity (IBEX) to the zebrafish retina. We optimised fluorescent antibody micro-conjugation to perform sequential rounds of labelling on a single tissue to simultaneously visualise all major retinal cell types with 11 cell-specific antibodies. We further adapted IBEX to be compatible with fluorescent transgenic reporter lines, in situ hybridisation chain reaction (HCR), and wholemount immunofluorescence (WMIF). We applied IBEX at multiple stages to study the spatial and temporal relationships between glia and neurons during retinal development. Finally, we demonstrate the utility of IBEX across species by testing it on the turquoise killifish (Nothobranchius furzeri) and African clawed frog (Xenopus laevis) to glean large amounts of information from precious tissues. These techniques will revolutionise our ability to visualise multiple cell types in any organism where antibodies are readily available.