Abstract Opioid use disorder (OUD) is a neuropsychological disease that has a devastating impact on public health. Substantial individual differences in vulnerability exist, the neurobiological substrates of which remain unclear. To address this question, we investigated genome-wide gene transcription (RNA-seq) and chromatin accessibility (ATAC-seq) in the medial prefrontal cortex (mPFC) of male and female rats exhibiting differential vulnerability in behavioral paradigms modeling different phases of OUD: Withdrawal-Induced Anhedonia (WIA), Demand, and Reinstatement. Ingenuity Pathway Analysis (IPA) of RNA-seq revealed greater changes in canonical pathways in Resilient (vs. Saline) rats in comparison to Vulnerable (vs. Saline) rats across 3 paradigms, suggesting brain adaptations that might contribute to resilience to OUD across its trajectory. Analyses of gene networks and upstream regulators implicated processes involved in oligodendrocyte maturation and myelination in WIA, neuroinflammation in Demand, and metabolism in Reinstatement. Motif analysis of ATAC-seq showed changes in chromatin accessibility to a small set of transcription factor (TF) binding sites as a function either of opioid exposure (i.e., morphine versus saline) generally or of individual vulnerability specifically. Some of these were shared across the 3 paradigms and others were unique to each. In conclusion, we have identified changes in biological pathways, TFs, and their binding motifs that vary with paradigm and OUD vulnerability. These findings point to the involvement of distinct transcriptional and epigenetic mechanisms in response to opioid exposure, vulnerability to OUD, and different stages of the disorder.

ABSTRACT Iron deficiency during the fetal-neonatal period results in long-term neurodevelopmental impairments associated with pervasive and widespread hippocampal gene dysregulation. Globally, fetal-neonatal iron deficiency produces both long-term activation and repression of hundreds of loci in the adult rat hippocampus. Prenatal choline (a methyl donor) supplementation can partially reverse these effects, suggesting an interaction between iron and choline in regulating the hippocampal transcriptome. To gain insights into the underlying epigenetic signatures, we integrate hippocampal transcriptomes and epigenetic marks of active (transposase accessible chromatin/ATAC) and repressed (H3K9me3 enrichment) genes in adult rats that had been exposed to fetal-neonatal iron deficiency with or without prenatal choline supplementation. Rats were made iron-deficient during fetal and neonatal period by limiting maternal iron intake from gestational day (G) 2 through postnatal day (P) 7. Choline (5.5 g/kg) was given to half of the pregnant dams during G11-18. This paradigm produced four comparison groups (Iron-sufficient [IS], Iron-deficient [ID], IS+choline [ISch], and ID+choline [IDch]). Hippocampi were collected from P65 males and analyzed for changes in chromatin conformation and histone H3K9me3 enrichment. ATAC-seq results accounted for 22% and 24%, whereas H3K9me3 enrichment accounted for 1.7% and 13% of differences in ID- and IDch-altered gene expression. These epigenetic changes were annotated onto gene networks regulating synaptic structure and plasticity, neuroinflammation, and reward circuits. The low correlation between gene dysregulation and changes in ATAC or H3K9me3 signatures indicate involvements of other epigenetic modifications. This study provides a genome-wide findings of stable epigenetic changes and lays a foundation for further analyses to elucidate more fully iron-dependent epigenetic mechanisms that underlie iron deficiency, choline supplementation, and their interactions in mediating long-term neural gene dysregulation. SIGNIFICANCE STATEMENT Early-life iron deficiency can lead to long-term neurocognitive dysfunction and persistent neural gene dysregulation, despite prompt iron replenishment, suggesting that iron deficiency results in long-term neuroepigenomic changes. This study combined RNA-seq, ATAC-seq, and ChIP-seq to provide the epigenetic basis for gene dysregulation due to fetal-neonatal iron deficiency and prenatal choline supplementation. We found that early-life iron deficiency alters epigenetic regulation of genes involved in neuronal development, cell signaling, neuroinflammation, and reward-related cognition. While choline supplementation to iron-deficient animals partially reverses these effects, it also leads to dysregulation of genes in iron-sufficient animals. The patterns of gene dysregulation were positively correlated with differences in chromatin accessibility and negatively correlated with repressive histone H3K9me3 modification. Our results indicate that these changes at the epigenetic level partially account for the long-term hippocampal gene dysregulation.

ABSTRACT Background Fetal-neonatal iron deficiency (ID) causes long-term neurocognitive and affective dysfunctions. Clinical and preclinical studies have shown that early-life ID produces sex-specific effects. However, little is known about the molecular mechanisms underlying these early-life ID-induced sex-specific effects on neural gene regulation. Objective To illustrate sex-specific transcriptome alteration in adult rat hippocampus induced by fetal-neonatal ID and prenatal choline treatment. Methods Pregnant rats were fed an iron-deficient (4 mg/kg Fe) or iron-sufficient (200 mg/kg Fe) diet from gestational day (G) 2 to postnatal day (P) 7 with or without choline supplementation (5 g/kg choline) from G11-18. Hippocampi were collected from P65 offspring of both sexes and analyzed for changes in gene expression. Results Both early-life ID and choline treatment induced transcriptional changes in adult female and male rat hippocampus. Both sexes showed ID-induced alterations in gene networks leading to enhanced neuroinflammation. In females, ID-induced changes indicating enhanced activity of oxidative phosphorylation and fatty acid metabolism, which are contrary to the ID effect in males. Prenatal choline supplementation induced the most robust changes in gene expression, particularly in the iron-deficient animals where it partially rescued ID-induced dysregulations. Choline supplementation also altered hippocampal transcriptome in the iron-sufficient rats with indications for both beneficial and adverse effects. Conclusions This study provided unbiased global assessments of gene expression regulated by iron and choline status in a sex-specific manner, with greater effects in female than male rats. Our new findings highlight potential sex-specific gene networks regulated by iron and choline status for further investigation.

Background Opioid abuse is a chronic disorder likely involving stable neuroplastic modifications. While a number of molecules contributing to these changes have been identified, the broader spectrum of genes and gene networks that are affected by repeated opioid administration remain understudied.Methods We employed Next-Generation RNA-sequencing (RNA-seq) to investigate changes in gene expression in adult male and female rats’ prefrontal cortex (PFC) following daily injection of morphine (5.0 mg/kg) for 10 days. Ingenuity Pathway Analysis (IPA) was used to analyze affected molecular pathways, gene networks, and associated regulatory factors.Results 90% of differentially expressed genes (DEGs) were upregulated in both males and females, with a 35% overlap between sexes. A substantial number of DEGs play roles in synaptic signaling and neuroplasticity. Although broadly similar, some differences were revealed in the gene ontology networks enriched in females and males (e.g., the endocannabinoid pathway in females and neuroinflammation in males).Conclusions Our results cohere with findings from previous studies based on a priori gene selection, while identifying broader gene networks activated by repeated opioid exposure. Our results also reveal novel genes and molecular pathways that are upregulated by repeated morphine exposure.