Abstract Neutrophils are rapidly recruited to inflammatory sites where they coordinate their migration to form clusters, a process termed neutrophil swarming. The factors which modulate neutrophil swarming during its early stages are not fully understood, requiring the development of new in vivo models. Using transgenic zebrafish larvae to study endogenous neutrophil migration in a tissue damage model, we demonstrate that neutrophil swarming is a conserved process in zebrafish immunity, sharing essential features with mammalian systems. We show that neutrophil swarms initially develop around a pioneer neutrophil, in a three-phase sequence of events. By adopting a high-resolution confocal microscopy approach, we observed the release of cell fragments by early swarming neutrophils. We developed a neutrophil specific histone H2A transgenic reporter line TgBAC(mpx:GFP)i114;Tg(lyz:H2A-mCherry)sh530 to study neutrophil extracellular traps (NETs), and found that endogenous neutrophils recruited to sites of tissue damage released NETs at the start of the swarming process. The optical transparency achieved using the zebrafish model has provided some of the highest resolution imaging of NET release in vivo to date. Using a combination of transgenic reporter lines and DNA intercalating agents, we demonstrate that pioneer neutrophils release extracellular traps during the swarming response, suggesting that cell death signalling via NETosis might be important in driving the swarming response.

Summary Class I PI3kinases coordinate the delivery of microbicidal effectors to the phagosome by forming the phosphoinositide lipid second messenger, phosphatidylinositol (3, 4, 5)-trisphosphate (PIP3). However, the dynamics of PIP3 in neutrophils during a bacterial infection are unknown. We have therefore developed an in vivo, live zebrafish infection model that enables visualisation of dynamic changes in Class 1 PI3kinases (PI3K) signalling on neutrophil phagosomes in real-time. We have identified that on approximately 12% of neutrophil phagosomes PHAkt-eGFP, a reporter for Class 1 PI3K signalling, re-recruits in pulsatile bursts. This phenomenon occurred on phagosomes containing structurally and morphologically distinct prey, including Staphylococcus aureus and Mycobacterium abscessus , and was dependent on the activity of the Class 1 PI3K isoform, PI3kinase γ. Detailed imaging suggested that ‘pulsing phagosomes’ represent neutrophils transiently reopening and reclosing phagosomes. This finding challenges the concept that phagosomes remain closed after prey engulfment and we propose that neutrophils occasionally use this alternative pathway of phagosome maturation to release phagosome contents and/or to restart phagosome maturation if digestion has stalled.