Staphylococcus aureus is an important human pathogen that causes a wide range of infections. Neutrophils are an essential component of our innate immune system and understanding S. aureus-neutrophil interactions on a sub-cellular level is crucial to developing new therapeutic strategies to promote immunity during S. aureus infections. To this end we have developed a multi-modal imaging platform capable of following host-pathogen processes in biological systems, this is achieved by switching imaging modalities between a low photo-toxicity and low resolution imaging modality through an increasing illumination intensity to achieve live super-resolution imaging. This novel imaging platform was applied to the study of human neutrophils infected by S. aureus . We show that we can image different infection stages of S. aureus in live neutrophils with super resolution microscopy. We see evidence of binary fission occurring in intracellular S. aureus within a neutrophil.

Summary Class I PI3kinases coordinate the delivery of microbicidal effectors to the phagosome by forming the phosphoinositide lipid second messenger, phosphatidylinositol (3, 4, 5)-trisphosphate (PIP3). However, the dynamics of PIP3 in neutrophils during a bacterial infection are unknown. We have therefore developed an in vivo, live zebrafish infection model that enables visualisation of dynamic changes in Class 1 PI3kinases (PI3K) signalling on neutrophil phagosomes in real-time. We have identified that on approximately 12% of neutrophil phagosomes PHAkt-eGFP, a reporter for Class 1 PI3K signalling, re-recruits in pulsatile bursts. This phenomenon occurred on phagosomes containing structurally and morphologically distinct prey, including Staphylococcus aureus and Mycobacterium abscessus , and was dependent on the activity of the Class 1 PI3K isoform, PI3kinase γ. Detailed imaging suggested that ‘pulsing phagosomes’ represent neutrophils transiently reopening and reclosing phagosomes. This finding challenges the concept that phagosomes remain closed after prey engulfment and we propose that neutrophils occasionally use this alternative pathway of phagosome maturation to release phagosome contents and/or to restart phagosome maturation if digestion has stalled.