Recent evidence suggests that several cattle breeds may be more resistant to infection with the zoonotic pathogen Mycobacterium bovis than others. Our data presented here suggests that the response to mycobacterial antigens varies in macrophages generated from Brown Swiss (BS) and Holstein Frisian (HF) cattle, two breeds belonging to the Bos taurus family. Whole genome sequencing of the Brown Swiss genome identified several potential candidate genes, in particular Toll-like Receptor-2 (TLR2) a pattern recognition receptor (PRR) that has previously been described to be involved in mycobacterial recognition. Further investigation revealed single nucleotide polymorphisms (SNP) in TLR2 that were identified between DNA isolated from cells of BS and HF cows. Interestingly, one specific SNP, H326Q, showed a different genotype frequency in two cattle subspecies, Bos taurus and Bos indicus. Cloning of the TLR2 gene and subsequent gene-reporter and chemokine assays revealed that this SNP, present in BS and Bos indicus breeds, resulted in a significantly higher response to mycobacterial antigens as well as tri-acylated lipopeptide ligands in general. Comparing wild-type and H326Q containing TLR2 responses, wild-type bovine TLR2 response showed clear, diminished mycobacterial antigen responses compared to human TLR2, however bovine TLR2 responses containing H326Q were found to be partially recovered compared to human TLR2. The creation of human:bovine TLR2 chimeras increased the response to mycobacterial antigens compared to the full-length bovine TLR2, but significantly reduced the response compared to the full-length human TLR2. Thus, our data, not only present evidence that TLR2 is a major PRR in the mammalian species-specific response to mycobacterial antigens, but furthermore, that there are clear differences between the response seen in different cattle breeds, which may contribute to their enhanced or reduced susceptibility to mycobacterial infection.

Abstract Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map) is the underlying pathogen causing bovine paratuberculosis (PTB), an enteric granulomatous disease that mainly affects ruminants and for which an effective treatment is needed. Macrophages are the primary target cells for Map, which survives and replicates intracellularly by inhibiting phagosome maturation. Neutrophils are present at disease sites during the early stages of the infection, but seem to be absent in the late stage, in contrast to healthy tissue. Although neutrophil activity has been reported to be impaired following Map infection, their role in PTB pathogenesis has not been fully defined. Neutrophils are capable of releasing extracellular traps consisting of extruded DNA and proteins that immobilize and kill microorganisms, but this mechanism has not been evaluated against Map. Our main objective was to study the interaction of neutrophils with macrophages during an in vitro mycobacterial infection. For this purpose, neutrophils and macrophages from the same animal were cultured alone or together in the presence of Map or Mycobacterium bovis Bacillus-Calmette-Guérin (BCG). Extracellular trap release, mycobacteria killing as well as IL-1β and IL-8 release were assessed. Neutrophils released extracellular traps against mycobacteria when cultured alone and in the presence of macrophages without direct cell contact, but resulted inhibited in direct contact. Macrophages were extremely efficient at killing BCG, but ineffective at killing Map. In contrast, neutrophils showed similar killing rates for both mycobacteria. Co-cultures infected with Map showed the expected killing effect of combining both cell types, whereas co-cultures infected with BCG showed a potentiated killing effect beyond the expected one, indicating a potential synergistic cooperation. In both cases, IL-1β and IL-8 levels were lower in co-cultures, suggestive of a reduced inflammatory reaction. These data indicate that cooperation of both cell types can be beneficial in terms of decreasing the inflammatory reaction while the effective elimination of Map can be compromised. These results suggest that neutrophils are effective at Map killing and can exert protective mechanisms against Map that seem to fail during PTB disease after the arrival of macrophages at the infection site.

Abstract The interfascicular matrix (IFM) is critical to the mechanical adaptations and response to load in energy-storing tendons, such as the human Achilles and equine superficial digital flexor tendon (SDFT). We hypothesized that the IFM is a tendon progenitor cell niche housing an exclusive cell subpopulation. Immunolabelling of equine SDFT was used to identify the IFM niche, localising expression patterns of CD31 (endothelial cells), CD146 (IFM cells) and LAMA4 (IFM basement membrane marker). Magnetic-activated cell sorting was employed to isolate and compare in vitro properties of CD146 + and CD146 - subpopulations. CD146 demarcated an exclusive interfascicular cell subpopulation that resides in proximity to a basal lamina which forms interconnected vascular networks. Isolated CD146 + cells exhibited limited mineralization (osteogenesis) and lipid production (adipogenesis). This study demonstrates that the IFM is a unique tendon cell niche, containing a vascular-rich network of basement membrane, CD31 + endothelial cells and CD146 + cell populations that are likely essential to tendon structure- and/or function. Interfascicular CD146 + subpopulations did not exhibit stem cell-like phenotypes and are more likely to represent a pericyte lineage. Previous work has shown that tendon CD146 cells migrate to sites of injury, therefore mobilisation of endogenous tendon IFM cell populations may promote intrinsic repair.

Abstract Canine Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic multifactorial disease, resulting from complex interactions between the intestinal immune system, microbiota and environmental factors in genetically predisposed dogs. Previously, we identified several single nucleotide polymorphisms (SNP) and regions on chromosomes (Chr) 7, 9, 11 and 13 associated with IBD in German shepherd dogs (GSD) using GWAS and FST association analyses. Here, building on our previous results, we performed a targeted next-generation sequencing (NGS) of a two Mb region on Chr 9 and 11 that included 14 of the newly identified candidate genes, in order to identify potential functional SNPs that could explain these association signals. Furthermore, correlations between genotype and treatment response were estimated. Results revealed several SNPs in the genes for canine EEF1A1 , MDH2 , IL3 , IL4 , IL13 and PDLIM , which, based on the known function of their corresponding proteins, further our insight into the pathogenesis of IBD in dogs. In addition, several pathways involved in innate and adaptive immunity and inflammatory responses (i.e. T helper cell differentiation, Th1 and Th2 activation pathway, communication between innate and adaptive immune cells and differential regulation of cytokine production in intestinal epithelial cells by IL-17A and IL-17F), were constructed involving the gene products in the candidate regions for IBD susceptibility. Interestingly, some of the identified SNPs were present in only one outcome group, suggesting that different genetic factors are involved in the pathogenesis of IBD in different treatment response groups. This also highlights potential genetic markers to predict the response in dogs treated for IBD.

Abstract Tuberculosis has severe impacts in both humans and animals. Understanding the genetic basis of survival of both Mycobacterium tuberculosis , the human adapted species, and Mycobacterium bovis , the animal adapted species is crucial to deciphering the biology of both pathogens. There are several studies that identify the genes required for survival of M. tuberculosis in vivo using mouse models, however, there are currently no studies probing the genetic basis of survival of M. bovis in vivo. In this study we utilise transposon insertion sequencing in M. bovis to determine the genes required for survival in cattle. We identify genes encoding established mycobacterial virulence functions such as the ESX-1 secretion system, PDIM synthesis, mycobactin synthesis and cholesterol catabolism that are required in vivo . We show that, as in M. tuberculosis, phoPR is required by M. bovis in vivo despite the known defect in signalling through this system. Comparison to studies performed in glycerol adapted species such as M. bovis BCG and M. tuberculosis suggests that there are differences in the requirement for genes involved in cholesterol import ( mce4 operon), oxidation ( hsd ) and detoxification ( cyp125 ). We report good correlation with existing mycobacterial virulence functions, but also find several novel virulence factors, including genes involved in protein mannosylation, aspartate metabolism and glycerol-phosphate metabolism. These findings further extend our knowledge of the genetic basis of survival in vivo in bacteria that cause tuberculosis and provide insight for the development of novel diagnostics and therapeutics. Importance This is the first report of the genetic requirements of an animal adapted member of the MTBC in a natural host. M. bovis has devastating impacts in cattle and bovine tuberculosis is a considerable economic, animal welfare and public health concern. The data highlight the importance of mycobacterial cholesterol catabolism and identifies several new virulence factors. Additionally, the work informs the development of novel differential diagnostics and therapeutics for TB in both human and animal populations.

Abstract Leptospira interrogans are invasive bacteria responsible for leptospirosis, a worldwide zoonosis. They possess two periplasmic endoflagella that allow their motility. L. interrogans are stealth pathogens that escape the innate immune responses of the NOD-like receptors NOD1/2, and the human Toll-like receptor (TLR)4, sensing peptidoglycan and lipopolysaccharide (LPS), respectively. TLR5 is another receptor of bacterial cell wall components, recognizing flagellin subunits. To study the contribution of TLR5 in the host defense against leptospires, we infected WT and TLR5 deficient mice with pathogenic L. interrogans and tracked the infection by in vivo live imaging of bioluminescent bacteria or by q-PCR. We did not identify any protective or inflammatory role of murine TLR5 to control pathogenic Leptospira . Likewise, subsequent in vitro experiments showed that infections with different live strains of L. interrogans and L. biflexa did not trigger TLR5. However, unexpectedly, heat-killed bacteria stimulated human and bovine TLR5, although barely mouse TLR5. Abolition of TLR5 recognition required extensive boiling time of the bacteria or proteinase K treatment, showing an unusual high stability of the leptospiral flagellins. Interestingly, using antimicrobial peptides to destabilize live leptospires, we detected some TLR5 activity, suggesting that TLR5 could participate in the fight against leptospires in humans or cattle. Using different Leptospira strains with mutations in flagellin proteins, we further showed that neither FlaAs nor Fcps participated in the recognition by TLR5, suggesting a role for the FlaBs. These have structural homology to Salmonella FliC, and conserved residues important for TLR5 activation, as shown by in silico analyses. Accordingly, we found that leptospires regulate the expression of FlaB mRNA according to the growth phase in vitro , and that infection with L. interrogans in hamsters and in mice downregulated the expression of the FlaBs but not the FlaAs subunits. Altogether, in contrast to different bacteria that modify their flagellin sequences to escape TLR5 recognition, our study suggests that the peculiar central localization and stability of the FlaB monomers in the periplasmic endoflagella, associated with the downregulation of FlaB subunits in hosts, constitute an efficient strategy of leptospires to escape TLR5 recognition and the immune response.

Abstract The Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) is a group of related pathogens that cause tuberculosis (TB) in mammals. MTBC species are distinguished by their ability to sustain in distinct host populations. While Mycobacterium bovis (Mbv) sustains transmission cycles in cattle and wild animals and causes zoonotic TB, M. tuberculosis (Mtb) affects human populations and seldom causes disease in cattle. However, the host and pathogen determinants driving host tropism between MTBC species are still unknown. Macrophages are the main host cell that encounters mycobacteria upon initial infection and we hypothesised that early interactions between the macrophage and mycobacteria influence species-specific disease outcome. To identify factors that contribute to host tropism, we analysed both blood-derived primary human and bovine macrophages (hMϕ or bMϕ, respectively) infected with Mbv and Mtb. We show that Mbv and Mtb reside in different cellular compartments and differentially replicate in hMϕ whereas both Mbv and Mtb efficiently replicate in bMϕ. Specifically, we show that out of the four infection combinations, only the infection of bMϕ with Mbv promoted the formation of multinucleated cells (MNCs), a hallmark of tuberculous granulomas. Mechanistically, we demonstrate that both MPB70 from Mbv and extracellular vesicles released by Mbv-infected bMϕ promote macrophage multi-nucleation. Importantly, we extend our in vitro studies to show that granulomas from Mbv-infected but not Mtb-infected cattle contained higher numbers of MNCs. Our findings implicate MNC formation in the contrasting pathology between Mtb and Mbv for the bovine host, and identify MPB70 from Mbv and extracellular vesicles from bMϕ as mediators of this process.

Abstract Innate immune receptors that form complexes with secondary receptors, activating multiple signalling pathways, modulate cellular activation and play essential roles in regulating homeostasis and immunity. We have previously identified a variety of bovine C-type lectin-like receptors that possess similar functionality than their human orthologues. Mincle ( CLEC4E ), a heavily glycosylated monomer, is involved in the recognition of the mycobacterial component Cord factor (trehalose 6,6′-dimycolate). Here we characterise the bovine homologue of Mincle (boMincle), and demonstrate that the receptor is structurally and functionally similar to the human orthologue (huMincle), although there are some notable differences. In the absence of cross-reacting antibodies, boMincle-specific antibodies were created and used to demonstrate that, like the human receptor, boMincle is predominantly expressed by myeloid cells. BoMincle surface expression increases during the maturation of monocytes to macrophages. However, boMincle mRNA transcripts were also detected in granulocytes, B cells, and T cells. Finally, we show that boMincle binds to isolated bovine CD4 + T cells in a specific manner, indicating the potential to recognize endogenous ligands. This suggests that the receptor might also play a role in homeostasis in cattle.

Abstract Members of the Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) show distinct host adaptations, preferences and phenotypes despite being >99% identical at the nucleic acid level. Previous studies have explored gene expression changes between the members, however few studies have probed differences in gene essentiality. To better understand the functional impacts of the nucleic acid differences between Mycobacterium bovis and Mycobacterium tuberculosis we used the Mycomar T7 phagemid delivery system to generate whole genome transposon libraries in laboratory strains of both species and compared the essentiality status of genes during growth under identical in vitro conditions. Libraries contained insertions in 54% of possible TA sites in M. bovis and 40% of those present in M. tuberculosis , achieving similar saturation levels to those previously reported for the MTBC. The distributions of essentiality across the functional categories were similar in both species. 527 genes were found to be essential in M. bovis whereas 477 genes were essential in M. tuberculosis and 370 essential genes were common in both species. CRISPRi was successfully utilised in both species to determine the impacts of silencing genes including wag31 , a gene involved in peptidoglycan synthesis and Rv2182c / Mb2204c , a gene involved in glycerophospholipid metabolism. We observed species specific differences in the response to gene silencing, with the inhibition of expression of Mb2204c in M. bovis showing significantly less growth impact than silencing its ortholog ( Rv2182c ) in M. tuberculosis . Given that glycerophospholipid metabolism is a validated pathway for antimicrobials, our observations suggest that target vulnerability in the animal adapted lineages cannot be assumed to be the same as the human counterpart. This is of relevance for zoonotic tuberculosis as it implies that the development of antimicrobials targeting the human adapted lineage might not necessarily be effective against the animal adapted lineage. The generation of a transposon library and the first reported utilisation of CRISPRi in M. bovis will enable the use of these tools to further probe the genetic basis of survival under disease relevant conditions.

Abstract Cheap, easy-to-produce oral vaccines are needed for control of coccidiosis in chickens to reduce the impact of this disease on welfare and economic performance. Saccharomyces cerevisiae yeast expressing three Eimeria tenella antigens were developed and delivered as heat-killed, freeze-dried whole yeast oral vaccines to chickens in four separate studies. After vaccination, E. tenella replication was reduced following low dose challenge (250 oocysts) in Hy-Line Brown layer chickens (p<0.01). Similarly, caecal lesion score was reduced in Hy-Line Brown layer chickens vaccinated using a mixture of S. cerevisiae expressing EtAMA1, EtIMP1 and EtMIC3 following pathogenic-level challenge (4,000 E. tenella oocysts; p<0.01). Mean body weight gain post-challenge with 15,000 E. tenella oocysts was significantly increased in vaccinated Cobb500 broiler chickens compared to mock-vaccinated controls (p<0.01). Thus, inactivated recombinant yeast vaccines offer cost-effective and scalable opportunities for control of coccidiosis, with relevance to broiler production and chickens reared in low-and middle-income countries (LMICs).