Tumor necrosis factor α (TNF-α) signaling gives rise to a number of events, including activation of transcription factor NF-κB and programmed cell death (apoptosis). Previous studies of TNF-α signaling have suggested that these two events occur independently. The sensitivity and kinetics of TNF-α-induced apoptosis are shown to be enhanced in a number of cell types expressing a dominant-negative IκBα (IκBαM). These findings suggest that a negative feedback mechanism results from TNF-α signaling in which NF-κB activation suppresses the signals for cell death.

The identification of monogenic and complex genes responsible for neurological disorders requires new approaches for delivering therapeutic protein genes to significant numbers of cells in the central nervous system. A lentivirus-based vector capable of infecting dividing and quiescent cells was investigated in vivo by injecting highly concentrated viral vector stock into the striatum and hippocampus of adult rats. Control brains were injected with a Moloney murine leukemia virus, adenovirus, or adeno-associated virus vector. The volumes of the areas containing transduced cells and the transduced-cell densities were stereologically determined to provide a basis for comparison among different viral vectors and variants of the viral vector stocks. The efficiency of infection by the lentivirus vector was improved by deoxynucleoside triphosphate pretreatment of the vector and was reduced following mutation of integrase and the Vpr-matrix protein complex involved in the nuclear translocation of the preintegration complex. The lentivirus vector system was able to efficiently and stably infect quiescent cells in the primary injection site with transgene expression for over 6 months. Triple labeling showed that 88.7% of striatal cells transduced by the lentivirus vector were terminally differentiated neurons.

Methylation patterns of specific genes have been studied by polymerase chain reaction and found to undergo dynamic changes in the germ line and early embryo. Some CpG sites are methylated in sperm DNA and unmodified in mature oocytes, indicating that the parental genomes have differential methylation profiles. These differences, however, are erased by a series of early embryonic demethylation and postblastula remodification events, which serve to reestablish the basic adult methylation pattern prior to organogenesis. During gametogenesis, all of these sites are unmethylated in primordial germ cells but eventually become remodified by 18.5 days postcoitum in both males and females. The final methylation profile of the mature germ cells is then formed by a multistep process of site-specific demethylation events. These results form a basis for the understanding of the biochemical mechanisms and role of DNA methylation in embryonic development.

Abstract

 The mouse insulin-like growth factor type 2 receptor (Igf2r) is imprinted and expressed exclusively from the maternally inherited chromosome. To investigate whether methylation could function as the imprinting signal, we have cloned 130 kb from the Igf2r locus and searched for sequences methylated in a parental-specific manner. Two regions have been identified: region 1 contains the start of transcription and is methylated only on the silent paternal chromosome; region 2 is contained in an intron and is methylated only on the expressed maternal chromosome. Methylation of region 1 is acquired after fertilization, in contrast with the methylation of region 2, which is inherited from the female gamete. Methylation of region 2 may mark the maternal Igf2r locus in a manner that could act as an imprinting signal. These data suggest that the expressed locus carries a potential imprinting signal and imply that methylation is necessary for expression of the Igf2r gene.

Abstract For more than a decade genetically engineered autologous T-cells have been successfully employed as immunotherapy drugs for patients with incurable blood cancers. The active component in some of these game-changing medicines are autologous T-cells that express viral vector-delivered chimeric antigen receptors (CARs), which specifically target proteins that are preferentially expressed on cancer cells. Some of these therapeutic CAR expressing T-cells (CAR-Ts) are engineered via transduction with γ-retroviral vectors (γ-RVVs) produced in a stable producer cell line that was derived from murine PG13 packaging cells (ATCC CRL-10686). Earlier studies reported on the co-packaging of murine virus-like 30S RNA (VL30) genomes with γ-retroviral vectors generated in murine stable packaging cells. In an earlier study VL30 mRNA was found to enhance the metastatic potential of human melanoma cells. These findings raise biosafety concerns regarding the possibility that therapeutic CAR-Ts have been inadvertently contaminated with potentially oncogenic VL30 retrotransposons. In this study, we demonstrated the presence of infectious VL30 particles in PG13 cells conditioned media and observed the ability of these particles to deliver transcriptionally active VL30 genomes to human cells. Notably, VL30 genomes packaged by HIV-1-based vector particles transduced naïve human cells in culture. Furthermore, we detected transfer and expression of VL30 genomes in clinical-grade CAR-Ts generated by transduction with PG13 cells-derived γ-retroviral vectors. Our findings raise biosafety concerns regarding the use of murine packaging cell lines in ongoing clinical applications.

The MiniMUGA genotyping array is a popular tool for genetic QC of laboratory mice and genotyping of samples from most types of experimental crosses involving laboratory strains, particularly for reduced complexity crosses. The content of the production version of the MiniMUGA array is fixed; however, there is the opportunity to improve array's performance and the associated report's usefulness by leveraging thousands of samples genotyped since the initial description of MiniMUGA in 2020. Here we report our efforts to update and improve marker annotation, increase the number and the reliability of the consensus genotypes for inbred strains and increase the number of constructs that can reliably be detected with MiniMUGA. In addition, we have implemented key changes in the informatics pipeline to identify and quantify the contribution of specific genetic backgrounds to the makeup of a given sample, remove arbitrary thresholds, include the Y Chromosome and mitochondrial genome in the ideogram, and improve robust detection of the presence of commercially available substrains based on diagnostic alleles. Finally, we have made changes to the layout of the report, to simplify the interpretation and completeness of the analysis and added a table summarizing the ideogram. We believe that these changes will be of general interest to the mouse research community and will be instrumental in our goal of improving the rigor and reproducibility of mouse-based biomedical research.

The laboratory mouse is the most widely used animal model for biomedical research, due in part to its well annotated genome, wealth of genetic resources and the ability to precisely manipulate its genome. Despite the importance of genetics for mouse research, genetic quality control (QC) is not standardized, in part due to the lack of cost effective, informative and robust platforms. Genotyping arrays are standard tools for mouse research and remain an attractive alternative even in the era of high-throughput whole genome sequencing. Here we describe the content and performance of a new Mouse Universal Genotyping Array (MUGA). MiniMUGA, an array-based genetic QC platform with over 11,000 probes. In addition to robust discrimination between most classical and wild-derived laboratory strains, MiniMUGA was designed to contain features not available in other platforms: 1) chromosomal sex determination, 2) discrimination between substrains from multiple commercial vendors, 3) diagnostic SNPs for popular laboratory strains, 4) detection of constructs used in genetically engineered mice, and 5) an easy to interpret report summarizing these results. In-depth annotation of all probes should facilitate custom analyses by individual researchers. To determine the performance of MiniMUGA we genotyped 6,899 samples from a wide variety of genetic backgrounds. The performance of MiniMUGA compares favorably with three previous iterations of the MUGA family of arrays both in discrimination capabilities and robustness. We have generated publicly available consensus genotypes for 241 inbred strains including classical, wild-derived and recombinant inbred lines. Here we also report the detection of a substantial number of XO and XXY individuals across a variety of sample types, the extension of the utility of reduced complexity crosses to genetic backgrounds other than C57BL/6, and the robust detection of 17 genetic constructs. There is preliminary but striking evidence that the array can be used to identify both partial sex chromosome duplication and mosaicism, and that diagnostic SNPs can be used to determine how long inbred mice have been bred independently from the main stock for a significant action of the genotyped inbred samples. We conclude that MiniMUGA is a valuable platform for genetic QC and important new tool to the increase rigor and reproducibility of mouse research.

Lentiviral vector-transduced T-cells were approved by the FDA as gene therapy anti-cancer medications. Little is known about the host genetic variation effects on the safety and efficacy of the lentiviral vector gene delivery system. To narrow this knowledge-gap, we characterized hepatic gene delivery by lentiviral vectors across the Collaborative Cross (CC) mouse genetic reference population. For 24 weeks, we periodically measured hepatic luciferase expression from lentiviral vectors in 41 CC mouse strains. Hepatic and splenic vector copy numbers were determined. We report that CC mouse strains showed highly diverse outcomes following lentiviral gene delivery. For the first time, moderate correlation between mouse strain-specific sleeping patterns and transduction efficiency was observed. We associated two quantitative trait loci (QTLs) with intra-strain variations in transduction phenotypes, which mechanistically relates to the phenomenon of metastable epialleles. An additional QTL was associated with the kinetics of hepatic transgene expression. Genes comprised in the above QTLs are potential targets to personalize gene therapy protocols. Importantly, we identified two mouse strains that open new directions in characterizing continuous viral vector silencing and HIV latency. Our findings suggest that wide range patient-specific outcomes of viral vector-based gene therapy should be expected. Thus, novel escalating dose based clinical protocols should be considered.