Abstract Unicellular organisms adapt to their changing environments by gene regulatory switches that sense chemical cues and induce specific target genes when the inducing signal is over a critical threshold. Using mathematical modeling we here show that, because growth rate sets the dilution rate of intra-cellular molecules, the sensitivity of gene regulatory switches generally decreases with growth rate, independent of their precise architecture. We confirm the modeling predictions by experimentally demonstrating that the concentration of inducer required for activating the lac operon in E. coli decreases quadratically with growth rate at the population level, and that growth-arrested cells become hyper-sensitive to inducer at the single-cell level. Moreover, we establish that this growth-coupled sensitivity allows bacteria to implement concentration-dependent sugar preferences, in which a new carbon source is used only if its concentration is high enough to improve upon the current growth rate of the cells. Using microfluidics in combination with time-lapse microscopy, we validate experimentally that this strategy governs how mixtures of glucose and lactose are used in E. coli and that the central regulator CRP plays a key role in implementing this strategy. Overall growth-coupled sensitivity provides a general mechanism through which cells can ‘mute’ external signals in beneficial conditions when growth is fast, and become highly sensitive to alternative nutrients or stresses when growth is slow or arrested.

Abstract Cells employ two different defense strategies against environmental stress: resistance, aimed at preserving cell proliferation by degrading the stressor, and tolerance, focused on ensuring cell survival, even at the expense of proliferation. These strategies are complementary, yet whether they are coordinated to ensure an optimal physiological stress response remains unknown. Here, we used microfluidics and live cell imaging to explore the genetic basis of the interplay between resistance and tolerance during the response to hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) in budding yeast. Our analysis unraveled that, among antioxidants, some were clearly associated with resistance while others contribute to tolerance. Furthermore, we found that the zwf1 Δ mutant, responsible for NADPH synthesis via the PPP pathway, exhibited a decrease in resistance that was counterbalanced by an unexpected exacerbation of tolerance to H 2 O 2 , thus revealing a trade-off that we further observed in E. coli . Our results support a model in which redox signaling triggers the switch to a nutrients-dependent non-proliferative tolerant state via inhibition of protein kinase A when the H 2 O 2 homeostatic response is overwhelmed. Our framework could help develop synergistic therapies that target both resistance and tolerance mechanisms to prevent drug-escape mechanisms and disease relapse.

Although it is well appreciated that gene expression is inherently noisy and that transcriptional noise is encoded in a promoter's sequence, little is known about the variation in transcriptional noise across growth conditions. Using flow cytometry we here quantify transcriptional noise in E. coli genome-wide across 8 growth conditions, and find that noise and gene regulation are intimately coupled. Apart from a growth-rate dependent lower bound on noise, we find that individual promoters show highly condition-dependent noise and that condition-dependent expression noise is shaped by noise propagation from regulators to their targets. A simple model of noise propagation identifies TFs that most contribute to both condition-specific and condition-independent noise propagation. The overall correlation structure of sequence and expression properties of E. coli genes uncovers that genes are organized along two principal axes, with the first axis sorting genes by their mean expression and evolutionary rate of their coding regions, and the second axis sorting genes by their expression noise, the number of regulatory inputs in their promoter, and their expression plasticity.

Abstract It is widely believed that, owing to the limitation of nutrients in natural environments, bacteria spend most of their life in a non-growing state. However, despite its major clinical and ecological implications, very little is known about what determines the phenotype of starved bacteria, in particular what controls the concentration of different gene products inside the cells. Using microfluidics and quantitative fluorescence microscopy, we monitored growth and gene expression in many independent E. coli lineages as we switched them from exponential growth to starvation. We observed that all cells stopped growing immediately and that no cell death occurred for more than two days. At the same time, gene expression undergoes a dramatic remodeling upon entry into starvation in a promoter-dependent manner. Some promoters, including ribosomal protein promoters, arrest gene expression immediately, others show a slow exponential decay of expression on a 10 h time scale, while a third category exhibits a transient burst of activity before decaying exponentially. Remarkably, the time dynamics of these changes are highly homogeneous across single cells. In addition, we demonstrated that the gene expression response does not qualitatively depend on the dynamics of starvation entry. Combining the observed time-dependent protein production and decay rates, we showed with mathematical modeling that a delay between growth arrest and shutdown of gene expression allows a massive increase in the concentration of certain proteins without requiring an upregulation of their expression. Moreover, protein concentrations deep in starvation appeared to be mainly determined by the expression dynamics during the first 10 h of starvation. Finally, we established that this expression program at the onset of starvation is critical for cell viability. In particular, by inhibiting gene expression during different periods of starvation, we were able to show that the tolerance to stress after 2 days is determined by gene expression occurring during the first 10 h, which thus constitutes a preventive response. These results provide a starting point for quantitative studies of cell maintenance and the emergence of specific phenotypes when nutrients become scarce.

Populations of bacteria often undergo a lag in growth when switching conditions. Because growth lags can be large compared to typical doubling times, variations in growth lag are an important but often overlooked component of bacterial fitness in fluctuating environments. We here explore how growth lag variation is determined for the archetypical switch from glucose to lactose as a carbon source in E. coli. First, we show that single-cell lags are bimodally distributed and controlled by a single-molecule trigger. That is, gene expression noise causes the population before the switch to divide into subpopulations with zero and nonzero lac operon expression. While 'sensorless' cells with zero pre-existing lac expression at the switch have long lags because they are unable to sense the lactose signal, any nonzero lac operon expression suffices to ensure a short lag. Second, we show that the growth lag at the population level depends crucially on the fraction of sensorless cells, and that this fraction in turn depends sensitively on the growth condition before the switch. Consequently, even small changes of basal expression affecting the fraction of sensorless cells can significantly affect population lags and fitness under switching conditions, and may thus be subject to significant natural selection. Indeed, we show that condition-dependent population lags vary across wild E. coli isolates. Since many sensory genes are naturally low expressed in conditions where their inducer is not present, bimodal responses due to subpopulations of sensorless cells may be a general mechanism inducing phenotypic heterogeneity and controlling population lags in switching environments. This mechanism also illustrates how gene expression noise can turn even simple sensory gene circuits into a bet-hedging module, and underlines the profound role of gene expression noise in regulatory responses.

Bacteria adapt to changes in their environment by regulating gene expression, often at the level of transcription. However, since the molecular processes underlying gene regulation are subject to thermodynamic and other stochastic fluctuations, gene expression is inherently noisy, and identical cells in a homogeneous environment can display highly heterogeneous expression levels. To study how stochasticity affects gene regulation at the single-cell level, it is crucial to be able to directly follow gene expression dynamics in single cells under changing environmental conditions. Recently developed microfluidic devices, used in combination with quantitative fluorescence time-lapse microscopy, represent a highly promising experimental approach, allowing tracking of lineages of single cells over long time-scales while simultaneously measuring their growth and gene expression. However, current devices do not allow controlled dynamical changes to the environmental conditions which are needed to study gene regulation. In addition, automated analysis of the imaging data from such devices is still highly challenging and no standard software is currently available. To address these challenges, we here present an integrated experimental and computational setup featuring, on the one hand, a new dual-input microfluidic chip which allows mixing and switching between two growth media and, on the other hand, a novel image analysis software which jointly optimizes segmentation and tracking of the cells and allows interactive user-guided fine-tuning of its results. To demonstrate the power of our approach, we study the lac operon regulation in E. coli cells grown in an environment that switches between glucose and lactose, and quantify stochastic lag times and memory at the single cell level.

Fluorescence flow cytometry is a highly attractive technology for quantifying single-cell expression distributions in bacteria in high- throughput. However, so far there has been no systematic investigation of the best practices for quantitative analysis of such data, what systematic biases exist, and what accuracy and sensitivity can be obtained. We here investigate these issues by systematically comparing flow cytometry measurements of fluorescent reporters in E. coli with measurements of the same strains in microscopic setups and develop a method for rigorous quantitative analysis of fluorescence flow cytometry data. We find that forward and side scatter cannot be used to reliably estimate cell size in bacteria. Second, we show that cytometry measurements contain a large shot noise component that can be easily mistaken for intrinsic noise in gene expression, and show how calibration measurements can be used to correct for this measurement shot noise. To aid other researchers with quantitative analysis of flow cytometry expression data in bacteria, we distribute E-Flow, an open-source R package that implements our methods for filtering cells based on forward and side scatter, and for estimating true biological expression means and variances from the fluorescence signal. The package is available at https://github.com/vanNimwegenLab/E-Flow.

Living cells proliferate by completing and coordinating two essential cycles, a division cycle that controls cell size, and a DNA replication cycle that controls the number of chromosomal copies in the cell. Despite lacking dedicated cell cycle control regulators such as cyclins in eukaryotes, bacteria such as E. coli manage to tightly coordinate those two cycles across a wide range of growth conditions, including situations where multiple nested rounds of replication progress simultaneously. Various cell cycle models have been proposed to explain this feat, but it has been impossible to validate them so far due to a lack of experimental tools for systematically testing their different predictions. Recently new insights have been gained on the division cycle through the study of the structure of fluctuations in growth, size, and division in individual cells. In particular, it was found that cell size appears to be controlled by an adder mechanism, i.e. the added volume between divisions is held approximately constant and fluctuates independently of growth rate and cell size at birth. However, how replication initiation is regulated and coupled to cell size control remains unclear, mainly due to scarcity of experimental measurements on replication initiation at the single-cell level. Here, we used time-lapse microscopy in combination with microfluidics to directly measure growth, division and replication in thousands of single E. coli cells growing in both slow and fast growth conditions. In order to compare different phenomenological models of the cell cycle, we introduce a statistical framework which assess their ability to capture the correlation structure observed in the experimental data. Using this in combination with stochastic simulations, our data indicate that, instead of thinking of the cell cycle as running from birth to division, one should consider the chromosome replication cycle as central and in control of the cell cycle through two adder mechanisms: the added volume since the last initiation event controls the timing of both the next division event and the next replication initiation event. Interestingly the double-adder mechanism identified in this study has recently been found to explain the more complex cell cycle of mycobacteria, suggesting shared control strategies across species.

Abstract Last year we published an article ( Witz et al ., 2019) in which we used time-lapse microscopy in combination with microfluidics to measure growth, division and replication in single E. coli cells on the one hand, and developed a new statistical analysis method to calculate the ability of different cell cycle models to capture the correlation structure observed in the data on the other hand. This led us to propose a new model of cell cycle control in E. coli which we called the double-adder model. Recently Le Treut et al. published a comment ( Le Treut et al ., 2020) on our article which made a number of highly critical claims, including allegations that our own data support a different model than the one we proposed, and that our model cannot reproduce the ‘adder phenotype’ observed in the data. We here show that all these allegations are false and based on basic analysis errors. Although our focus is on explaining the errors in the analysis of Le Treut et al, we have attempted to make the presentation of interest to a broader scientific audience by discussing the issues in the context of what our current understanding is of the bacterial cell cycle, and to what extent recent data either support or reject various proposed models.