Abstract New approaches are urgently needed to enhance the radioiodide (RAI) ablation of aggressive and metastatic thyroid cancer. We recently discovered that valosin-containing protein inhibitors (VCPi) such as clotrimazole and disulfiram transiently block sodium iodide symporter (NIS) proteasomal degradation, hence promoting RAI uptake. However, poor bioavailability diminishes their potential impact in vivo . Following 3D modelling and iterative drug design we appraised 26 novel analogues of clotrimazole, as well as albumin nano-encapsulated copper-diethyldithiocarbamate [Cu(DDC) 2 -alb] – a stabilised reformulation of a disulfiram metabolite. While several clotrimazole analogues specifically increased RAI uptake, the greatest impact was observed with Cu(DDC) 2 -alb in thyroid cancer cells as well as human primary thyrocytes from patients with thyroid hyperplasia. NanoBRET assays revealed that Cu(DDC) 2 enhanced the plasma membrane accumulation of NIS in living cells. In BALB/c mice, both intraperitoneal and intravenous administration of Cu(DDC) 2 -alb significantly enhanced thyroidal 99m Tc-uptake. RNA-Seq revealed the surprising observation that Cu(DDC) 2 -alb induced key thyroid transcription factors. Accordingly, expression of PAX8 and NKX2.1 was upregulated in thyroid glands from drug treated mice, with NIS levels correlating closely to 99m Tc-uptake. As Cu(DDC) 2 inhibits the VCP cofactor NPL4, with VCP being critical to the proteostatic processing of NIS protein, we identify a new dual agonist of RAI uptake in vivo , with the potential to directly impact RAI therapy for patients with aggressive thyroid cancer.

Background: Hypoxia is central to many cardiac pathologies, but clinically its presence can only be inferred by indirect biomarkers including hypoperfusion and energetic compromise. Imaging hypoxia directly could offer new opportunities for the diagnosis and sub-stratification of cardiovascular diseases. Objectives: To determine whether [64Cu]CuCTS Positron Emission Tomography (PET) can identify hypoxia in a murine model of cardiac hypertrophy. Methods: Male C57BL/6 mice underwent abdominal aortic constriction (AAC) to induce cardiac hypertrophy, quantified by echocardiography over 4 weeks. Hypoxia and perfusion were quantified in vivo using [64Cu]CuCTS and [64Cu]CuGTSM PET, respectively, and radiotracer biodistribution was quantified post-mortem. Cardiac radiotracer retention was correlated with contractile function (measured by echocardiography), cardiac hypertrophy (measured by histology), HIF-1a; stabilization and NMR-based metabolomics. The effect of anesthesia on [64Cu]CuCTS uptake was additionally investigated in a parallel cohort of mice injected with radiotracer while conscious. Results: Hearts showed increased LV wall thickness, reduced ejection fraction and fractional shortening following AAC. [64Cu]CuCTS retention was 317% higher in hypertrophic myocardium (p<0.001), despite there being no difference in perfusion measured by 64CuGTSM. Radiotracer retention correlated on an animal-by-animal basis with severity of hypertrophy, contractile dysfunction, HIF1a; stabilization and metabolic signatures of hypoxia. [64Cu]CuCTS uptake in hypertrophic hearts was significantly higher when administered to conscious animals. Conclusions: [64Cu]CuCTS PET can quantify cardiac hypoxia in hypertrophic myocardium, independent of perfusion, suggesting the hypoxia is caused by increased oxygen diffusion distances at the subcellular level. Alleviation of cardiac workload by anesthesia in preclinical models partially alleviates this effect.

ABSTRACT The sodium/iodide symporter (NIS) frequently shows diminished plasma membrane (PM) targeting in differentiated thyroid cancer (DTC), resulting in suboptimal radioiodide (RAI) treatment and poor prognosis. The mechanisms which govern the endocytosis of NIS away from the PM are ill-defined. Here, we challenged the hypothesis that new mechanistic understanding of NIS endocytosis would facilitate prediction of patient outcomes and enable specific drug modulation of RAI uptake in vivo. Through mutagenesis, NanoBiT interaction assays, cell surface biotinylation assays, RAI uptake and NanoBRET, we identify an acidic dipeptide within the NIS C-terminus which mediates binding to the σ2 subunit of the Adaptor Protein 2 (AP2) heterotetramer. We discovered that the FDA-approved drug chloroquine modulates NIS accumulation at the PM in a functional manner that is AP2 dependent. In vivo, chloroquine treatment of BALB/c mice significantly enhanced thyroidal uptake of 99m Tc pertechnetate in combination with the histone deacetylase (HDAC) inhibitor SAHA, accompanied by increased thyroidal NIS mRNA. Bioinformatic analyses validated the clinical relevance of AP2 genes with disease-free survival in RAI-treated DTC, enabling construction of an AP2 gene-related risk score classifier for predicting recurrence. We propose that NIS internalisation is orchestrated by the interaction of a C-terminal diacidic motif with AP2σ2, together with the proto-oncogene PBF acting via AP2μ2. Given that NIS internalisation was specifically druggable in vivo, our data provide new translatable potential for improving RAI therapy using FDA-approved drugs in patients with aggressive thyroid cancer. Summary We delineate the role of endocytic genes in regulating NIS activity at the plasma membrane and highlight the potential for systemic targeting of endocytosis to enhance radioiodine effectiveness in radioiodine-refractory cancer cells.

Despite a rise in clinical use of radiopharmaceutical therapies, the biological effects of radionuclides and their relationship with absorbed radiation dose are poorly understood. Here, we set out to define this relationship for Auger electron emitters [