Using a model of lethal oral infection with Toxoplasma gondii, we examined the fate of both induced and natural regulatory T (Treg) cells in the face of strong inflammatory responses occurring in a tolerogenic-prone environment. We found that during highly T helper 1 (Th1) cell-polarized mucosal immune responses, Treg cell numbers collapsed via multiple pathways, including blockade of Treg cell induction and disruption of endogenous Treg cell homeostasis. In particular, shutdown of interleukin 2 (IL-2) in the highly Th1 cell-polarized environment triggered by infection directly contributes to Treg cell incapacity to suppress effector responses and eventually leads to immunopathogenesis. Furthermore, we found that environmental cues provided by both local dendritic cells and effector T cells can induce the expression of T-bet transcription factor and IFN-γ by Treg cells. These data reveal a mechanism for Th1 cell pathogenicity that extends beyond their proinflammatory program to limit Treg cell survival.

The intestinal tract is in intimate contact with the commensal microflora. Nevertheless, how commensals communicate with cells to ensure immune homeostasis is still unclear. In this study, we found that gut flora DNA (gfDNA) plays a major role in intestinal homeostasis through Toll-like receptor 9 (TLR9) engagement. Tlr9−/− mice displayed increased frequencies of CD4+Foxp3+ regulatory T (Treg) cells within intestinal effector sites and reduced constitutive IL-17- and IFN-γ-producing effector T (Teff) cells. Complementing this, gfDNA limited lamina propria dendritic cell-induced Treg cell conversion in vitro. Further, Treg/Teff cell disequilibrium in Tlr9−/− mice led to impaired immune responses to oral infection and to oral vaccination. Impaired intestinal immune responses were recapitulated in mice treated with antibiotics and were reversible after reconstitution with gfDNA. Together, these data point to gfDNA as a natural adjuvant for priming intestinal responses via modulation of Treg/Teff cell equilibrium.

To facilitate genotyping of Toxoplasma gondii in vitreous fluid of patients with severe or atypical ocular toxoplasmosis, polymerase chain reaction (PCR) restriction fragment length polymorphism (RFLP) assays were developed for SAG3 (p43) and SAG4 (p18), 2 single-copy surface antigen genes. Together with strategies for SAG1, SAG2, and B1, multilocus RFLP analyses were performed on PCR-amplified parasite DNA present in 12 clinical specimens. Most samples (8/12) were not infected by type II or type III mouse-avirulent strains. Only 1 type III and 3 type II strains were identified, all from immunosuppressed patients. In 6 otherwise healthy adults and in 1 immunosuppressed patient, the SAG1 allele associated with mouse virulence was amplified. Of 12 samples, 3 possessed true type I strains; 5 of 12 had new recombinant genotypes with alleles typical of type I or III strains at all loci examined. The unusual bias toward type I and/or recombinant genotypes bearing the SAG1 type I allele associated with mouse virulence in immunocompetent adults has important implications for the epidemiology and efficacious treatment of ocular toxoplasmosis.

Vitamin A and its metabolite, retinoic acid (RA) are implicated in the regulation of immune homeostasis via the peripheral induction of regulatory T cells. Here we showed RA was also required to elicit proinflammatory CD4+ helper T cell responses to infection and mucosal vaccination. Retinoic acid receptor alpha (RARα) was the critical mediator of these effects. Antagonism of RAR signaling and deficiency in RARα (Rara−/−) resulted in a cell-autonomous CD4+ T cell activation defect, which impaired intermediate signaling events, including calcium mobilization. Altogether, these findings reveal a fundamental role for the RA-RARα axis in the development of both regulatory and inflammatory arms of adaptive immunity and establish nutritional status as a broad regulator of adaptive T cell responses.

Induction of immunity that limits Toxoplasma gondii infection in mice is critically dependent on the activation of the innate immune response. In this study, we investigated the role of cytoplasmic nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat containing a pyrin domain (NLRP) inflammasome sensors during acute toxoplasmosis in mice. We show that in vitro Toxoplasma infection of murine bone marrow-derived macrophages activates the NLRP3 inflammasome, resulting in the rapid production and cleavage of interleukin-1β (IL-1β), with no measurable cleavage of IL-18 and no pyroptosis. Paradoxically, Toxoplasma-infected mice produced large quantities of IL-18 but had no measurable IL-1β in their serum. Infection of mice deficient in NLRP3, caspase-1/11, IL-1R, or the inflammasome adaptor protein ASC led to decreased levels of circulating IL-18, increased parasite replication, and death. Interestingly, mice deficient in NLRP1 also displayed increased parasite loads and acute mortality. Using mice deficient in IL-18 and IL-18R, we show that this cytokine plays an important role in limiting parasite replication to promote murine survival. Our findings reveal T. gondii as a novel activator of the NLRP1 and NLRP3 inflammasomes in vivo and establish a role for these sensors in host resistance to toxoplasmosis.Inflammasomes are multiprotein complexes that are a major component of the innate immune system. They contain "sensor" proteins that are responsible for detecting various microbial and environmental danger signals and function by activating caspase-1, an enzyme that mediates cleavage and release of the proinflammatory cytokines interleukin-1β (IL-1β) and IL-18. Toxoplasma gondii is a highly successful protozoan parasite capable of infecting a wide range of host species that have variable levels of resistance. We report here that T. gondii is a novel activator of the NLRP1 and NLRP3 inflammasomes in vivo and establish a role for these sensors in host resistance to toxoplasmosis. Using mice deficient in IL-18 and IL-18R, we show that the IL-18 cytokine plays a pivotal role by limiting parasite replication to promote murine survival.

Abstract Toxoplasma gondii is among the most prevalent parasites worldwide, infecting many wild and domestic animals and causing zoonotic infections in humans. T. gondii differs substantially in its broad distribution from closely related parasites that typically have narrow, specialized host ranges. To elucidate the genetic basis for these differences, we compared the genomes of 62 globally distributed T. gondii isolates to several closely related coccidian parasites. Our findings reveal that tandem amplification and diversification of secretory pathogenesis determinants is the primary feature that distinguishes the closely related genomes of these biologically diverse parasites. We further show that the unusual population structure of T. gondii is characterized by clade-specific inheritance of large conserved haploblocks that are significantly enriched in tandemly clustered secretory pathogenesis determinants. The shared inheritance of these conserved haploblocks, which show a different ancestry than the genome as a whole, may thus influence transmission, host range and pathogenicity.

Toxoplasma gondii is a zoonotic protozoan parasite which infects nearly one third of the human population and is found in an extraordinary range of vertebrate hosts. Its epidemiology depends heavily on horizontal transmission, especially between rodents and its definitive host, the cat. Neospora caninum is a recently discovered close relative of Toxoplasma, whose definitive host is the dog. Both species are tissue-dwelling Coccidia and members of the phylum Apicomplexa; they share many common features, but Neospora neither infects humans nor shares the same wide host range as Toxoplasma, rather it shows a striking preference for highly efficient vertical transmission in cattle. These species therefore provide a remarkable opportunity to investigate mechanisms of host restriction, transmission strategies, virulence and zoonotic potential. We sequenced the genome of N. caninum and transcriptomes of the invasive stage of both species, undertaking an extensive comparative genomics and transcriptomics analysis. We estimate that these organisms diverged from their common ancestor around 28 million years ago and find that both genomes and gene expression are remarkably conserved. However, in N. caninum we identified an unexpected expansion of surface antigen gene families and the divergence of secreted virulence factors, including rhoptry kinases. Specifically we show that the rhoptry kinase ROP18 is pseudogenised in N. caninum and that, as a possible consequence, Neospora is unable to phosphorylate host immunity-related GTPases, as Toxoplasma does. This defense strategy is thought to be key to virulence in Toxoplasma. We conclude that the ecological niches occupied by these species are influenced by a relatively small number of gene products which operate at the host-parasite interface and that the dominance of vertical transmission in N. caninum may be associated with the evolution of reduced virulence in this species.

Abstract The advent of new sequencing technologies has provided access to genome-wide markers which may be evaluated for their association with phenotypes. Recent studies have leveraged these technologies and sequenced hundreds and sometimes thousands of strains to improve the accuracy of genotype-phenotype predictions. Sequencing of thousands of strains is not practical for many research groups which argues for the formulation of new strategies to improve predictability using lower sample sizes and more cost-effective methods. We introduce here a novel computational algorithm called POPSICLE that leverages the local genetic variations to infer blocks of shared ancestries to construct complex evolutionary relationships. These evolutionary relationships are subsequently visualized using chromosome painting, as admixtures and as clades to acquire general as well as specific ancestral relationships within a population. In addition, POPSICLE evaluates the ancestral blocks for their association with phenotypes thereby bridging two powerful methodologies from population genetics and genome-wide association studies. In comparison to existing tools, POPSICLE offers substantial improvements in terms of accuracy, speed and automation. We evaluated POPSICLE’s ability to find genetic determinants of Artemisinin resistance within P. falciparum using 57 randomly selected strains, out of 1,612 that were used in the original study. POPSICLE found Kelch, a gene implicated in the original study, to be significant (p-value 0) towards resistance to Artemisinin. We further extended this analysis to find shared ancestries among closely related P. falciparum, P. reichenowi and P. gaboni species from the Laverania subgenus of Plasmodium. POPSICLE was able to accurately infer the population structure of the Laverania subgenus and detected 4 strains from a chimpanzee in Koulamoutou with significant shared ancestries with P. falciparum and P. gaboni. We simulated 4 datasets to asses if these shared ancestries indicated a hybrid or mixed infections involving P. falciparum and P. gaboni . The analysis based on the simulated data and genome-wide heterozygosity profiles of the strains indicate these are most likely mixed infections although the possibility of hybrids cannot be ruled out. POPSICLE is a java-based utility that requires no installation and can be downloaded freely from https://popsicle-admixture.sourceforge.io/ Author Summary The associations between genotypes and phenotypes have traditionally been performed using markers such as single nucleotide polymorphisms. Often, these markers are independently evaluated for their association with phenotypes. A genomic region is deemed significant if multiple markers with significance colocalize. However, multiple markers that are in linkage disequilibrium can sometimes work synergistically and contribute to phenotypic variations. These synergistic associations across markers and across subpopulations have traditionally been captured by population genetic approaches that determine local ancestries. We sought to bridge these two powerful but independent methodologies to improve genotype-phenotype predictions. We developed a new software called POPSICLE that employs an innovative approach to determine local ancestries and evaluates them for their association with phenotypes. Validity of POPSICLE in determining the genes that are responsible for Plasmodium Falciparum’s resistance to Artemisinin and in determining the population structure of Laverania subgenus of Plasmodium are discussed.

Abstract How virulent parasites are maintained in nature is an important paradigm of eukaryotic pathogenesis. Here we used population genetics and molecular methods to study the evolution and emergence of genetic variants of the protozoan parasite Toxoplasma gondii, referred collectively as Type X (HG12), recovered from a threatened marine mammal species. Specifically, 53 T. gondii strains were isolated from southern sea otters (SSO) that stranded between 1998-2004 with T. gondii infection (ranging from chronic incidental infections to fatal encephalitis). Over 74% of these SSO, collected throughout their geographic range, were infected with Type X, based on multi-locus PCR-DNA sequencing. Depending on the locus investigated, Type X strains possessed one of three allelic types that had independently assorted across the strains examined; either genetically distinct alleles, referred to as “ψ” or “8”, or a Type II allele. Phylogenetic incongruence among locus-specific trees, genome-wide CGH array and WGS analyses confirmed that Type X is a sexual clade of natural recombinants that resemble F1 progeny from a genetic cross between Type II and a mosaic of two distinct “ψ” or “δ” ancestries. A single Type X genotype (19/53; 36%) that largely caused subclinical chronic infections in SSO, was highly pathogenic to mice (LD 100 = 1 parasite). To determine whether murine virulence genes could be mapped within this population of natural isolates, we performed a genome scan and identified four QTLs with LOD scores greater than 4.0. Targeted disruption of ROP33, the strongest candidate from among 16 genes within the highest QTL on Chromosome VIIa established ROP33 as a murine virulence locus. The ability of this highly pathogenic mouse-virulent T. gondii clone to expand its environmental niche and infect a majority of SSO supports a virulence shift model whereby generalist pathogens like T. gondii utilize their sexual cycles to produce new strains that possess an expanded biological potential. Such a trait enables pathogens to extend their host range or be naturally selected within their vast intermediate host range to maximize transmission. Our work establishes a rationale for how virulent strains can be maintained cryptically in nature across a pathogen’s broad host range, and act as potential reservoirs for epidemic disease. Importance Waterborne outbreaks of protozoal parasites are capable of causing fatal disease in a wide range of animals, including humans. Population expansion of felids in addition to anthropogenic changes near marine estuarine environments may facilitate marine wildlife exposure to highly infectious Toxoplasma gondii oocysts shed in felid feces. Infected cats shed millions of environmentally-resistant T. gondii oocysts that can be widely dispersed by storm events. In North America T. gondii is thought to possess a highly clonal population structure dominated by 4 clonal lineages (I, II, III, and X). Population genetic analysis of 53 T. gondii isolates collected longitudinally from SSO infected with T. gondii that stranded between 1998-2004 identified 74% of otters infected with Type X T. gondii , and that Type X is not a clonal lineage, but rather a recombinant clade of at least 12 distinct strains consistent with a recent genetic cross. Importantly, one Type X haplotype was isolated from 36% of southern sea otters ( Enhydra lutris neries ) across their geographic range in California. This haplotype was highly pathogenic to mice but caused relatively benign infections in SSO. A genome scan was performed to identify a virulence locus; a secreted serine threonine kinase (ROP33) that enhanced pathogenicity in laboratory mice, but not sea otters. Our data support a virulence shift model whereby generalist pathogens like T. gondii utilize their sexual cycles to produce virulent strains that can be maintained cryptically in nature, according to their differential capacity to cause disease within the pathogen’s broad intermediate host range. This type of “host selection” has important public health implications. Strains capable of causing fatal infections can persist in nature by circulating as chronic infections in resistant intermediate host species that act as reservoirs for epidemic disease.