Bacterial species often comprise well-separated lineages, likely emerged and maintained by genetic isolation and/or ecological divergence. How these two evolutionary actors interact in the shaping of bacterial population structure is currently not fully understood. In this study, we investigated the genetic and ecological drivers underlying the evolution of Serratia marcescens, an opportunistic pathogen with high genomic flexibility and able to colonise diverse environments. Comparative genomic analyses revealed a population structure composed of five deeply-demarcated genetic clusters with open pan-genome but limited inter-cluster gene flow, partially explained by Restriction-Modification (R-M) systems incompatibility. Furthermore, a large-scale research on hundred-thousands metagenomic datasets revealed only a partial ecological separation of the clusters. Globally, two clusters only showed a peculiar gene composition and evident ecological adaptations. These results suggest that genetic isolation preceded ecological adaptations in the shaping of the species diversity, suggesting an evolutionary scenario for several bacterial species.

Abstract Background Candidate Phyla Radiation (CPR) is a large monophyletic group thought to cover about 25% of bacterial diversity. Due to peculiar characteristics and unusual 16S rRNA gene structure, they are often under-represented or lost in 16S rRNA-based microbiota surveys. Among CPR, “ Candidatus Saccharibacteria” is a phylum experimentally found to modulate the immune response and enriched in the oral microbiota of subjects suffering from several immune-mediated disorders, e.g. food allergies, as reported by us in a previous work. Due to the growing evidence of “ Ca . Saccharibacteria”’s role in clinical settings and in order to unravel its role in host physiology and pathology, it is crucial to have a reliable method to detect and quantify this lineage. Methods and Results Four qPCR protocols for quantifying “ Ca. Saccharibacteria” (one targeting the 23S rRNA gene and three the 16S) were selected from the literature among the few available. Efficiency and coverage of primer pairs used in these protocols were preliminary evaluated via in silico analyses on the “ Ca. Saccharibacteria” known taxonomic variability, and then tested in vitro on the salivary DNA previously investigated by 16S metagenomics in the food allergy study. In silico analyses evidenced that the 23S qPCR protocol covered more “ Ca . Saccharibacteria” variability compared to the 16S-based ones, and that the 16S metagenomics primers were the most comprehensive. qPCR experiments confirmed that 16S-based protocols strongly underestimated “ Ca . Saccharibacteria” while the 23S protocol was the only one to yield results comparable to 16S metagenomics both in terms of correlation and absolute quantification. However, only 16S metagenomics evidenced an expansion of “ Ca . Saccharibacteria” in allergic subjects compared to controls, while none of the four qPCR protocols detected it. Conclusion These results underline the current limits in experimentally approaching “ Ca . Saccharibacteria”. To obtain a more realistic picture of their abundance within bacterial communities, and to enable more efficient taxonomic resolution, it is essential to find novel experimental strategies. This is a necessary premise for more targeted and systematic functional studies to clarify the role of “ Ca . Saccharibacteria” and, generally, CPR bacteria, in maintaining the health of the host.

Culture-independent approaches are commonly used to characterise the taxonomic composition of bacterial communities. Among these approaches, the amplicon-based metagenomics relies on specific genetic markers, such as the 16S rRNA gene, while the shotgun metagenomics annotates the whole bacterial DNA. Despite the 16S being the gold standard marker, studies highlighted its inefficiency in characterising and quantifying divergent bacterial groups such as the Candidate Phyla Radiation. On the other hand, shotgun metagenomics is highly informative and accurate but it is more expensive and requires computational resources and time. In this study, we propose RecA as a pan-bacterial genetic marker, particularly suitable for the Candidate Phyla Radiation. Indeed, we found that applying a Random Forest machine learning model on RecA amino acid sequences provides an accurate and fast taxonomic annotation across the whole bacterial tree of life. Ultimately, we produced Forestax, a tool for the characterisation and quantification of bacterial communities in metagenomics data, on the basis of RecA sequences. The analyses showed that RecA-based metagenomics has a taxonomic accuracy comparable to other multi-gene approaches, reinforcing RecA as a powerful marker for taxonomic annotation in bacteria. In perspective, RecA could be considered as a broad-spectrum marker for amplicon-based studies to overcome the limits of 16S rRNA.