Summary Bacterial Healthcare Associated Infections (HAIs) are a major threat worldwide, which can be counteracted by establishing effective infection control measures, guided by constant surveillance and timely epidemiological investigations. Genomics is crucial in modern epidemiology but lacks standard methods and user-friendly software, accessible to users without a strong bioinformatics proficiency. To overcome these issues we developed P-DOR, a novel tool for rapid bacterial outbreak characterization. P-DOR accepts genome assemblies as input, it automatically selects a background of publicly available genomes using k-mer distances and adds it to the analysis dataset before inferring a SNP-based phylogeny. Epidemiological clusters are identified considering the phylogenetic tree topology and SNP distances. By analyzing the SNP-distance distribution, the user can gauge the correct threshold. Patient metadata can be inputted as well, to provide a spatio-temporal representation of the outbreak. The entire pipeline is fast and scalable and can be also run on low-end computers. Availability and implementation P-DOR is implemented in Python3 and R and can be installed using conda environments. It is available from GitHub https://github.com/SteMIDIfactory/P-DOR under the GPL-3.0 license.

Abstract Background Candidate Phyla Radiation (CPR) is a large monophyletic group thought to cover about 25% of bacterial diversity. Due to peculiar characteristics and unusual 16S rRNA gene structure, they are often under-represented or lost in 16S rRNA-based microbiota surveys. Among CPR, “ Candidatus Saccharibacteria” is a phylum experimentally found to modulate the immune response and enriched in the oral microbiota of subjects suffering from several immune-mediated disorders, e.g. food allergies, as reported by us in a previous work. Due to the growing evidence of “ Ca . Saccharibacteria”’s role in clinical settings and in order to unravel its role in host physiology and pathology, it is crucial to have a reliable method to detect and quantify this lineage. Methods and Results Four qPCR protocols for quantifying “ Ca. Saccharibacteria” (one targeting the 23S rRNA gene and three the 16S) were selected from the literature among the few available. Efficiency and coverage of primer pairs used in these protocols were preliminary evaluated via in silico analyses on the “ Ca. Saccharibacteria” known taxonomic variability, and then tested in vitro on the salivary DNA previously investigated by 16S metagenomics in the food allergy study. In silico analyses evidenced that the 23S qPCR protocol covered more “ Ca . Saccharibacteria” variability compared to the 16S-based ones, and that the 16S metagenomics primers were the most comprehensive. qPCR experiments confirmed that 16S-based protocols strongly underestimated “ Ca . Saccharibacteria” while the 23S protocol was the only one to yield results comparable to 16S metagenomics both in terms of correlation and absolute quantification. However, only 16S metagenomics evidenced an expansion of “ Ca . Saccharibacteria” in allergic subjects compared to controls, while none of the four qPCR protocols detected it. Conclusion These results underline the current limits in experimentally approaching “ Ca . Saccharibacteria”. To obtain a more realistic picture of their abundance within bacterial communities, and to enable more efficient taxonomic resolution, it is essential to find novel experimental strategies. This is a necessary premise for more targeted and systematic functional studies to clarify the role of “ Ca . Saccharibacteria” and, generally, CPR bacteria, in maintaining the health of the host.

In this work we present EasyPrimer, a user-friendly online tool developed to assist pan-PCR and High Resolution Melting (HRM) primer design. The tool finds the most suitable regions for primer design in a gene alignment and returns a clear graphical representation of their positions on the gene. EasyPrimer is particularly useful in difficult contexts, e.g. on gene alignments of hundreds of sequences and/or on highly variable genes. HRM analysis is an emerging method for fast and cost saving bacterial typing and an HRM scheme of six primer sets on five Multi-Locus Sequence Type (MLST) genes is already available for Klebsiella pneumoniae . We validated the tool designing a scheme of two HRM primer sets on the hypervariable gene wzi of Klebsiella pneumoniae and compared the two schemes. The wzi scheme resulted to have a discriminatory power comparable to the HRM MLST scheme, using only one third of primer sets. Then we successfully used the wzi HRM primer scheme to reconstruct a Klebsiella pneumoniae nosocomial outbreak in few hours. The use of hypervariable genes reduces the number of HRM primer sets required for bacterial typing allowing to perform cost saving, large-scale surveillance programs.

Abstract Objectives Subspecies pathogen typing is a pivotal tool to detect the emergence of high-risk clones in hospital settings and to limit their spreading among patients. Unfortunately, the most used subspecies typing methods (i.e. Pulsed-field Gel Electrophoresis - PFGE, Multi-Locus Sequence Typing - MLST and Whole Genome Sequencing - WGS) are too expensive and time consuming to be suitable for real-time surveillance. Here we present Hypervariable-Locus Melting Typing (HLMT), a novel subspecies typing approach based on High Resolution Melting (HRM) analysis, which allows pathogen typing in a few hours and with ∼5 euros per sample. Methods HLMT types the strains by clustering them using melting temperatures (HLMT-clustering) and/or by assigning them to Melting Types (MTs) on the basis of a reference dataset (HLMT-assignment). We applied HLMT (clustering and typing) to 134 Klebsiella pneumoniae strains collected during outbreaks or surveillance programs in four hospitals. Then, we compared HLMT typing results to PFGE, MLST and WGS. Results HLMT-clustering distinguishes most of the K. pneumoniae high-risk clones with a sensitivity comparable to PFGE and MLST. It also drawed surveillance epidemiological curves comparable to those obtained by MLST, PFGE and WGS typing. Furthermore, the results obtained by HLMT-assignment were coherent to MLST for 96% of the typed strains with a Jaccard index of 0.912. Conclusions HLMT is a fast and scalable method for pathogen typing, suitable for real-time hospital microbiological surveillance. HLMT is also inexpensive and thus it is applicable to infection control programs in low-middle income countries.