Abstract We have identified camelid single-domain antibodies (VHHs) that cross-neutralize SARS-CoV-1 and −2, such as VHH72, which binds to a unique highly conserved epitope in the viral receptor-binding domain (RBD) that is difficult to access for human antibodies. Here, we establish a protein engineering path for how a stable, long-acting drug candidate can be generated out of such a VHH building block. When fused to human IgG1-Fc, the prototype VHH72 molecule prophylactically protects hamsters from SARS-CoV-2. In addition, we demonstrate that both systemic and intranasal application protects hACE-2-transgenic mice from SARS-CoV-2 induced lethal disease progression. To boost potency of the lead, we used structure-guided molecular modeling combined with rapid yeast-based Fc-fusion prototyping, resulting in the affinity-matured VHH72_S56A-Fc, with subnanomolar SARS-CoV-1 and −2 neutralizing potency. Upon humanization, VHH72_S56A was fused to a human IgG1 Fc with optimized manufacturing homogeneity and silenced effector functions for enhanced safety, and its stability as well as lack of off-target binding was extensively characterized. Therapeutic systemic administration of a low dose of VHH72_S56A-Fc antibodies strongly restricted replication of both original and D614G mutant variants of SARS-CoV-2 virus in hamsters, and minimized the development of lung damage. This work led to the selection of XVR011 for clinical development, a highly stable anti-COVID-19 biologic with excellent manufacturability. Additionally, we show that XVR011 is unaffected in its neutralizing capacity of currently rapidly spreading SARS-CoV-2 variants, and demonstrate its unique, wide scope of binding across the Sarbecovirus clades.

Abstract In the standard toolkit for recombinant protein expression, the yeast known in biotechnology as Pichia pastoris (formally: Komagataella phaffii ) takes up the position between E. coli and HEK293 or CHO mammalian cells, and is used by thousands of laboratories both in academia and industry. The organism is eukaryotic yet microbial, and grows to extremely high cell densities while secreting proteins into its fully defined growth medium, using very well established strong inducible or constitutive promoters. Many products made in Pichia are in the clinic and in industrial markets. Pichia is also a favoured host for the rapidly emerging area of ‘precision fermentation’ for the manufacturing of food proteins. However, the earliest steps in the development of the industrial strain (NRRL Y-11430/CBS 7435) that is used throughout the world were performed prior to 1985 in industry (Phillips Petroleum Company) and are not in the public domain. Moreover, despite the long expiry of associated patents, the patent deposit NRRL Y-11430/CBS 7435 that is the parent to all commonly used industrial strains, is not or no longer made freely available through the resp. culture collections. This situation is far from ideal for what is a major chassis for synthetic biology, as it generates concern that novel applications of the system are still encumbered by licensing requirements of the very basic strains. In the spirit of open science and freedom to operate for what is a key component of biotechnology, we set out to resolve this by using genome sequencing of type strains, reverse engineering where necessary, and comparative protein expression and strain characterisation studies. We find that the industrial strains derive from the K. phaffii type strain lineage deposited as 54-11.239 in the UC Davis Phaff Yeast Strain collection by Herman Phaff in 1954. This type strain has valid equivalent deposits that are replicated/derived from it in other yeast strain collections, incl. in ARS-NRRL NRRL YB-4290 (deposit also made by Herman Phaff) and NRRL Y-7556, CBS 2612 and NCYC 2543. We furthermore discovered that NRRL Y-11430 and its derivatives carry an ORF-truncating mutation in the HOC1 cell wall synthesis gene, and that reverse engineering of a similar mutation in the NCYC 2543 type strain imparts the high transformability that is characteristic of the industrial strains. Uniquely, the NCYC 2543 type strain, which we propose to call ‘OPENPichia’ henceforth, is freely available from the NCYC culture collection, incl. resale and commercial production licenses at nominal annual licensing fees 1 . Furthermore, our not-for-profit research institute VIB has also acquired a resale/distribution license from NCYC, which we presently use to openly provide to end-users our genome-sequenced OPENPichia subclone strain and its derivatives, i.e., currently the highly transformable hoc1 tr and the his4 auxotrophic mutants. To complement the OPENPichia platform, a fully synthetic modular gene expression vector building toolkit was developed, which is also openly distributed, for any purpose. We invite other researchers to contribute to our open science resource-building effort to establish a new unencumbered standard chassis for Pichia synthetic biology.

Abstract Monoclonal antibodies are the leading drug of the biopharmaceutical market because of their high specificity and tolerability, but the current CHO-based manufacturing platform remains expensive and time-consuming leading to limited accessibility, especially in the case of diseases with high incidence and pandemics. Therefore, there is an urgent need for an alternative production system. In this study, we present a rapid and cost-effective microbial platform for heavy chain-only antibodies (VHH-Fc) in the methylotrophic yeast Komagataella phaffii (aka Pichia pastoris ). We demonstrate the potential of this platform using a simplified single-gene VHH-Fc fusion construct instead of the conventional monoclonal antibody format, as this is more easily expressed in Pichia pastoris . We demonstrate that the Pichia -produced VHH-Fc fusion construct is stable and that a Pichia -produced VHH-Fc directed against the SARS-CoV-2 spike has potent SARS-CoV-2 neutralizing activity in vitro and in vivo . We expect that this platform will pave the way towards faster and cheaper development and production of broadly neutralizing single-chain antibodies in yeast.

While transcriptome- and proteome-wide technologies to assess processes in protein biogenesis up to the ribosome-associated stages are now widely available, we still lack global approaches to assay post-ribosomal processes, in particular those occurring in the eukaryotic secretory system. We developed SECRiFY to simultaneously assess the secretability of >105 heterologous protein fragments by two yeast species, S. cerevisiae and P. pastoris, using custom fragment libraries, surface display and a sequencing-based readout. SECRiFY generates datasets that enable datamining into protein features underlying secretability, and it will enable studies of the impact of secretory system perturbation on the secretable proteome.