Characterizing the equilibrium ensemble of folding pathways, including their relative probability, is one of the major challenges in protein folding theory today. Although this information is in principle accessible via all-atom molecular dynamics simulations, it is difficult to compute in practice because protein folding is a rare event and the affordable simulation length is typically not sufficient to observe an appreciable number of folding events, unless very simplified protein models are used. Here we present an approach that allows for the reconstruction of the full ensemble of folding pathways from simulations that are much shorter than the folding time. This approach can be applied to all-atom protein simulations in explicit solvent. It does not use a predefined reaction coordinate but is based on partitioning the state space into small conformational states and constructing a Markov model between them. A theory is presented that allows for the extraction of the full ensemble of transition pathways from the unfolded to the folded configurations. The approach is applied to the folding of a PinWW domain in explicit solvent where the folding time is two orders of magnitude larger than the length of individual simulations. The results are in good agreement with kinetic experimental data and give detailed insights about the nature of the folding process which is shown to be surprisingly complex and parallel. The analysis reveals the existence of misfolded trap states outside the network of efficient folding intermediates that significantly reduce the folding speed.

The importance of curvature as a structural feature of biological membranes has been recognized for many years and has fascinated scientists from a wide range of different backgrounds. On the one hand, changes in membrane morphology are involved in a plethora of phenomena involving the plasma membrane of eukaryotic cells, including endo- and exocytosis, phagocytosis and filopodia formation. On the other hand, a multitude of intracellular processes at the level of organelles rely on generation, modulation, and maintenance of membrane curvature to maintain the organelle shape and functionality. The contribution of biophysicists and biologists is essential for shedding light on the mechanistic understanding and quantification of these processes.

T cells use their T cell receptors (TCRs) to discriminate between lower-affinity self and higher-affinity foreign peptide major-histocompatibility-complexes (pMHCs) based on the TCR/pMHC off-rate. It is now appreciated that T cells generate mechanical forces during this process but how force impacts the TCR/pMHC off-rate remains unclear. Here, we measured the effect of mechanical force on the off-rate of multiple TCR/pMHC interactions. Unexpectedly, we found that lower-affinity pMHCs with faster solution off-rates were more resistant to mechanical force (weak slip or catch bonds) than higher-affinity interactions (strong slip bonds), and this was confirmed by molecular dynamic simulations. Consistent with these findings, we show that the best characterized catch-bond, involving the OT-I TCR, has a low affinity and an exceptionally fast solution off-rate. Our findings imply that reducing forces on the TCR/pMHC interaction improves antigen discrimination and we suggest this new force-shielding role for the adhesion receptors CD2 and LFA-1. One sentence summary Mechanical forces disproportionately accelerate the off-rates of higher-affinity antigens reducing T cell antigen discrimination

Abstract Several bacterial toxins and viruses can deform membranes through multivalent binding to lipids for clathrin-independent endocytosis. However, it remains unclear, how membrane deformation and endocytic internalization are mechanistically linked. Here we show that many lipid-binding virions induce membrane deformation and clathrin-independent endocytosis, suggesting a common mechanism based on multivalent lipid binding by globular particles. We create a synthetic cellular system consisting of a lipid-anchored receptor in the form of GPI-anchored anti-GFP nanobodies and a multivalent globular binder exposing 180 regularly-spaced GFP molecules on its surface. We show that these globular, 40 nm diameter, particles bind to cells expressing the receptor, deform the plasma membrane upon adhesion and become endocytosed in a clathrin-independent manner. We explore the role of the membrane adhesion energy in endocytosis by using receptors with affinities varying over 7 orders of magnitude. Using this system, we find that once a threshold in adhesion energy is overcome to allow for membrane deformation, endocytosis occurs reliably. Multivalent, binding-induced membrane deformation by globular binders is thus sufficient for internalization to occur and we suggest it is the common, purely biophysical mechanism for lipid-binding mediated endocytosis of toxins and pathogens.

Abstract T cells are sensitive to 1 to 10 foreign-peptide-MHC complexes among a vast majority of self-peptide-MHC complexes, and discriminate selectively between peptide-MHC complexes that differ not much in their binding affinity to T-cell receptors (TCRs). Quantitative models that aim to explain this sensitivity and selectivity largely focus on single TCR/peptide-MHC complexes, but T cell adhesion involves a multitude of different complexes. In this article, we demonstrate in a three-dimensional computational model of T-cell adhesion that the cooperative stabilization of close-contact zones is sensitive to 1 to 3 foreign-peptide-MHC complexes and occurs at a rather sharp threshold affinity of these complexes, which implies selectivity. In these close-contact zones with lateral extensions of hundred to several hundred nanometers, few TCR/foreign-peptide-MHC complexes and many TCR/self-peptide-MHC complexes are segregated from LFA-1/ICAM-1 complexes that form at larger membrane separations. Previous high-resolution microscopy experiments indicate that the sensitivity and selectivity in the formation of closed-contact zones reported here is relevant for T-cell recognition, because the stabilization of close-contact zones by foreign, agonist peptide-MHC complexes precedes T-cell signaling and activation in the experiments.

Naturally occurring cellulose Iβ with its characteristic parallel orientation of cellulose chains is less stable than cellulose II, in which neighboring pairs of chains are oriented antiparallel to each other. While the distinct hydrogen-bond patterns of these two cellulose crystal forms are well established, the energetic role of the hydrogen bonds for crystal stability, in comparison to the van der Waals (vdW) and overall electrostatic interactions in the crystals, is a matter of current debate. In this article, we investigate the relative stability of celluloses Iβ and II in energy minimizations with classical force fields. We find that the larger stability of cellulose II results from clearly stronger electrostatic interchain energies that are only partially compensated for by stronger vdW interchain energies in cellulose Iβ. In addition, we show that a multipole description of hydrogen bonds that includes the COH groups of donor and acceptor oxygen atoms leads to consistent interchain hydrogen-bond energies that account for roughly 70% and 75% of the interchain electrostatics in celluloses Iβ and II, respectively.

Naturally occuring cellulose Iβ with its characteristic parallel orientation of cellulose chains is less stable than cellulose II, in which neighbouring pairs of chains are oriented antiparallel to each other. While the distinct hydrogen-bond patterns of these two cellulose crystal forms are well established, the energetic role of the hydrogen bonds for crystal stability, in comparison to the van der Waals and overall electrostatic interactions in the crystals, is a matter of current debate. In this article, we investigate the relative stability of cellulose Iβ and II in molecular dynamics simulations and energy minimizations. We find that the larger stability of cellulose II results from clearly stronger electrostatic interchain energies that are only partially compensated by stronger van der Waals interchain energies in cellulose Iβ. A decomposition of the electrostatic interchain energies into interaction energies of neutral subgroups of atom leads to a consistent multipole description of hydrogen bonds and to interchain hydrogen-bond energies that account for roughly 80% of the interchain electrostatics in cellulose II.

Abstract Ligand binding and conformational changes of biomacromolecules play a central role in the regulation of cellular processes. It is important to understand how both are coupled and what their role is in biological function. The biochemical properties, conformational states, and structural dynamics of periplasmic substrate-binding proteins (abbreviated SBPs or PBPs), which are associated with a wide range of membrane proteins, have been extensively studied over the past decades. Their ligand-binding mechanism, i.e., the temporal order of ligand-protein interactions and conformational changes, however, remains a subject of controversial discussion. We here present a biochemical and biophysical analysis of the E. coli glutamine-binding protein GlnBP concerning ligand binding and its coupling to conformational changes. For this, we used a combination of experimental techniques including isothermal titration calorimetry, single-molecule Förster resonance energy transfer, and surface-plasmon resonance spectroscopy. We found that both apo- and holo-GlnBP show no detectable exchange between open and (semi-)closed conformations on timescales between 100 ns and 10 ms. Furthermore, we also demonstrate that ligand binding and conformational changes in GlnBP are highly correlated. A global analysis of our results is consistent with a dominant induced-fit mechanism, where the ligand binds GlnBP prior to conformational rearrangements. Importantly, we suggest that the rigorous experimental and theoretical framework used here can be applied to other protein systems where the coupling mechanism of conformational changes and ligand binding is yet unclear or where doubts prevail.

Abstract We investigate the structural and orientational variability of the membrane-embedded T cell receptor (TCR) – CD3 complex in extensive atomistic molecular dynamics simulations based on the recent cryo-EM structure determined by Dong et al. ( 2019 ). We find that the TCR extracellular (EC) domain is highly variable in its orientation by attaining tilt angles relative to the membrane normal that range from 15° to 55°. The tilt angle of the TCR EC domain is both coupled to a rotation of the domain and to characteristic changes throughout the TCR – CD3 complex, in particular in the EC interactions of the Cβ FG loop of the TCR, as well as in the orientation of transmembrane helices. The concerted motions of the membrane-embedded TCR – CD3 complex revealed in our simulations provide atomistic insights for force-based models of TCR activation, which involve such structural changes in response to tilt-inducing forces on antigen-bound TCRs.

Chimeric antigen receptor (CAR)-T cells exhibit low antigen sensitivity, which restricts their therapeutic efficacy and leads to patient relapses when cancer cells downregulate antigen expression. Despite the pressing need to overcome this limitation, the underlying mechanisms remain poorly understood. Here, we demonstrate that enhancing CAR sensitivity to match the sensitivity of the T-cell receptor (TCR) can be achieved by engineering matched extracellular sizes of CAR/antigen and CD2/CD58 complexes. We find that different CAR/antigen sizes, which are generated by different CAR architectures and different target antigens, require a different CD2/CD58 size to optimise sensitivity. This extracellular size-matching improves antigen engagement and co-localisation of CAR/antigen and CD2/CD58 complexes. We also find that size-matching controls co-inhibition of CARs by PD-1/PD-L1. These findings highlight the importance of size-matching for signal integration by surface receptors and offers a new approach to tune CAR-T cell sensitivity by matching or mismatching extracellular sizes.