Abstract Enhancer hijacking, a common cause of gene misregulation linked to disease, occurs when non-matching enhancers and promoters interact ectopically. This interaction is made possible by genetic changes that alter the arrangement or insulation of gene regulatory landscapes. While the concept of enhancer hijacking is well understood, the specific reasons behind the variation in phenotypic severity or the point at which those phenotypes become evident remain unexplored. In this work, we expand on the ectopic activation of the hindlimb-specific transcription factor Pitx1 by one of its own enhancers, Pen , in forelimb tissues that causes the Liebenberg syndrome. We combine a previously developed in-embryo cell-tracing approach to a series of inversions and relocations to show that reduction in Pitx1 - Pen relative genomic positioning leads to increased proportions of Pitx1 forelimb-expressing cells and more severe phenotypical outcomes. We demonstrate that the Pitx1 locus assumes an active topology when enhancer-promoter contacts are required for transcription and that its promoter generates consistent transcription levels across different alleles. Finally, we show that changes in 3D chromatin structure and enhancer-promoter contacts are not the result of Pitx1 transcriptional activity. In summary, our work shows that variation in enhancer-promoter interactions can lead to pathogenic locus activation in variable proportions of cells which, in turn, define phenotypic severity.

Abstract Repertoires of transcriptional enhancers orchestrate gene expression during embryonic development, thereby shaping the forms and functions of organs. Within these repertoires individual enhancers display spatially distinct or overlapping activities that collectively build up the expression domain of cognate genes. However, the temporal specificity of these enhancers - how their activities change over developmental time to dynamically influence gene expression - remains uncharacterized. Here, we observed that temporally restricted enhancer repertoires are embedded at numerous loci associated with mouse limb development. To monitor how such enhancer repertoires govern gene transcription in vivo across extensive developmental periods, we introduce the regulatory trajectory framework. This paradigm conceptually involves transcriptional initiation, marking the beginning of gene expression, followed by its maintenance over time, and ultimately decommissioning, leading to gene repression. To track and sort cells undergoing these distinct phases, we devised a transgenic recorder approach at the Shox2 model locus. Through this method, we discovered that cells maintaining Shox2 transcription in early and late limb development relies on distinct, temporally restricted enhancer repertoires. We demonstrate that eliminating early-or late-acting enhancers only transiently affects Shox2 expression indicating that these enhancer repertoires function independently. Additionally, we found that changes in the 3D topology of the locus associate with enhancer activities and that a rapid loss of enhancer-promoter contacts occurs during decommissioning. Finally, we show that the decommissioning of the Shox2 locus can be actively driven by Hoxd13 , a gene which expression is known to antagonize Shox2 . Overall, our work uncovers the dependency of developmental genes on enhancers with temporally restricted activities to generate complex expression patterns over time and shed light on the dynamics of enhancer-promoter interactions.

Abstract Most developmental genes rely on multiple transcriptional enhancers for their accurate expression during embryogenesis. Because enhancers may have partially redundant activities, the loss of one of them often leads to a partial loss of gene expression and concurrent moderate phenotypic outcome, if any. While such a phenomenon has been observed in many instances, the nature of the underlying mechanisms remains elusive. We used the Pitx1 testbed locus to characterize in detail the regulatory and cellular identity alterations following the deletion in vivo of one of its enhancers ( Pen ), which normally accounts for 30 percent of Pitx1 expression in hindlimb buds. By combining single cell transcriptomics and a novel in embryo cell tracing approach, we observed that this global decrease in Pitx1 expression results from both an increase in the number of non- or low-expressing cells, and a decrease in the number of high-expressing cells. We found that the over-representation of Pitx1 non/low-expressing cells originates from a failure of the Pitx1 locus to coordinate enhancer activities and 3D chromatin changes. The resulting increase in Pitx1 non/low-expressing cells eventually affects the proximal limb more severely than the distal limb, leading to a clubfoot phenotype likely produced through a localized heterochrony and concurrent loss of irregular connective tissue. This data suggests that, in some cases, redundant enhancers may be used to locally enforce a robust activation of their host regulatory landscapes.