SUMMARY Small hairpin RNAs (shRNAs) allow highly efficient gene knockdown. Here we employed different shRNAs to knock down the reticulon RTN4A/NogoA in primary neurons. Depletion of NogoA correlates with altered synaptic protein composition and spontaneous neurotransmission. However, similar phenotypes are not observed upon genetic deletion of Nogo or its receptors. Step-wise introduction of mismatches in the seed region of shNogoA provides further evidence that synaptic phenotypes are NogoA-independent. RNA sequencing revealed global changes in the neuronal transcriptome of cultures transduced with the original shNogoA or closely related variants. Transcriptomic changes are shRNA seed sequence dependent, but not target-specific. Parallel sequencing of small non-coding RNAs revealed dysregulation of microRNAs. Computational analysis shows that the altered miRNA composition correlates with changes in mRNA expression and preferentially affects protein-protein networks that function at synapses. Thus, off-target effects associated with shRNAs are an inherent property, and in particular, altered miRNA composition needs careful consideration.

Abstract Upon trauma, the adult murine PNS displays a remarkable degree of spontaneous anatomical and functional regeneration. To explore extrinsic mechanisms of neural repair, we carried out single cell analysis of naïve mouse sciatic nerve, peripheral blood mononuclear cells, and crushed sciatic nerves at 1-day, 3-days, and 7-days following injury. During the first week, monocytes and macrophages (Mo/Mac) rapidly accumulate in the injured nerve and undergo extensive metabolic reprogramming. Proinflammatory Mo/Mac in the injured nerve show high glycolytic flux compared to Mo/Mac in blood and dominate the early injury response. They subsequently give way to inflammation resolving Mac, programmed toward oxidative phosphorylation. Nerve crush injury causes partial leakiness of the blood-nerve-barrier, proliferation of endoneurial and perineurial stromal cells, and accumulation of select serum proteins. Micro-dissection of the nerve injury site and distal nerve, followed by single-cell RNA-sequencing, identified distinct immune compartments, triggered by mechanical nerve wounding and Wallerian degeneration, respectively. This finding was independently confirmed with Sarm1 -/- mice, where Wallerian degeneration is greatly delayed. Experiments with chimeric mice showed that wildtype immune cells readily enter the injury site in Sarm1-/- mice, but are sparse in the distal nerve, except for Mo. We used CellChat to explore intercellular communications in the naïve and injured PNS and report on hundreds of ligand-receptor interactions. Our longitudinal analysis represents a new resource for nerve regeneration, reveals location specific immune microenvironments, and reports on large intercellular communication networks. To facilitate mining of scRNAseq datasets, we generated the injured sciatic nerve atlas (iSNAT): https://cdb-rshiny.med.umich.edu/Giger_iSNAT/

Abstract Acute respiratory viral infections (ARVI), such as pneumovirus and respiratory picornavirus infections, exacerbate disease in COPD and asthma patients. A research program targeting respiratory syncytial virus (RSV) led to the discovery of GS-7682 ( 1 ) a novel phosphoramidate prodrug of a 4′-CN-4-aza-7,9-dideazaadenosine C -nucleoside GS-646089 ( 2 ) with broad antiviral activity against RSV EC 50 = 3-46 nM, human metapneumovirus (hMPV) EC 50 = 210 ± 50 nM, human rhinovirus (RV) EC 50 = 54-61 nM, and enterovirus (EV) EC 50 = 83-90 nM. Prodrug optimization for cellular potency and lung cell metabolism identified the 5’-methyl(( S )-hydroxy(phenoxy)phosphoryl)-L-alaninate in combination with 2’,3’-diisobutyrate promoieties as optimal for high intracellular triphosphate formation in vitro and in vivo. 1 demonstrated significant reductions of viral loads in the lower respiratory tract of RSV-infected African green monkeys when administered once daily via intratracheal nebulized aerosol. Together these finding support additional evaluation of 1 and its analogs as a potential therapeutic for pneumo- and picornaviruses.

Abstract Hedgehog signaling controls tissue patterning during embryonic and postnatal development and continues to play important roles throughout life. Characterizing the full complement of Hedgehog pathway components is essential to understanding its wide- ranging functions. Previous work has identified Neuropilins, established Semaphorin receptors, as positive regulators of Hedgehog signaling. Neuropilins require Plexin co- receptors to mediate Semaphorin signaling, but a role for Plexins in Hedgehog signaling has not yet been explored. Here, we provide evidence that multiple Plexins promote Hedgehog signaling in NIH/3T3 fibroblasts and that Plexin loss-of-function in these cells results in significantly reduced Hedgehog pathway activity. Catalytic activity of the Plexin GTPase activating protein (GAP) domain is required for Hedgehog signal promotion, and constitutive activation of the GAP domain further amplifies Hedgehog signaling. Additionally, we demonstrate that Plexins promote Hedgehog signaling at the level of GLI transcription factors and that this promotion requires intact primary cilia. Finally, we find that Plexin loss-of-function significantly reduces the response to Hedgehog α pathway activation in the mouse dentate gyrus. Together, these data identify Plexins as novel components of the Hedgehog pathway and provide insight into their mechanism of action.

Abstract Upon peripheral nervous system (PNS) injury, severed axons undergo rapid SARM1-dependent Wallerian degeneration (WD). In mammals, the role of SARM1 in PNS regeneration, however, is unknown. Here we demonstrate that Sarm1 is not required for axotomy induced activation of neuron-intrinsic growth programs and axonal growth into a nerve crush site. However, in the distal nerve, Sarm1 is necessary for the timely induction of the Schwann cell (SC) repair response, nerve inflammation, myelin clearance, and regeneration of sensory and motor axons. In Sarm1-/- mice, regenerated fibers exhibit reduced axon caliber, defective nerve conduction, and recovery of motor function is delayed. The growth hostile environment of Sarm1-/- distal nerve tissue was demonstrated by grafting of Sarm1-/- nerve into WT recipients. SC lineage tracing in injured WT and Sarm1-/- mice revealed morphological differences. In the Sarm1-/- distal nerve, the appearance of p75 NTR +, c-Jun+ SCs is significantly delayed. Ex vivo , p75 NTR and c-Jun upregulation in Sarm1-/- nerves can be rescued by pharmacological inhibition of ErbB kinase. Together, our studies show that Sarm1 is not necessary for the activation of neuron intrinsic growth programs but in the distal nerve is required for the orchestration of cellular programs that underlie rapid axon extension.