The deep sequencing of 16S rRNA genes amplified by universal primers has revolutionized our understanding of microbial communities by allowing the characterization of the diversity of the uncultured majority. However, some universal primers also amplify eukaryotic rRNA genes, leading to a decrease in the efficiency of sequencing of prokaryotic 16S rRNA genes with possible mischaracterization of the diversity in the microbial community. In this study, we compared 16S rRNA gene sequences from genome-sequenced strains and identified candidates for non-degenerate universal primers that could be used for the amplification of prokaryotic 16S rRNA genes. The 50 identified candidates were investigated to calculate their coverage for prokaryotic and eukaryotic rRNA genes, including those from uncultured taxa and eukaryotic organelles, and a novel universal primer set, 342F-806R, covering many prokaryotic, but not eukaryotic, rRNA genes was identified. This primer set was validated by the amplification of 16S rRNA genes from a soil metagenomic sample and subsequent pyrosequencing using the Roche 454 platform. The same sample was also used for pyrosequencing of the amplicons by employing a commonly used primer set, 338F-533R, and for shotgun metagenomic sequencing using the Illumina platform. Our comparison of the taxonomic compositions inferred by the three sequencing experiments indicated that the non-degenerate 342F-806R primer set can characterize the taxonomic composition of the microbial community without substantial bias, and is highly expected to be applicable to the analysis of a wide variety of microbial communities.

DNA polymerases often incorporate non-canonical nucleotide, i.e., ribonucleoside triphosphates into the genomic DNA. Aberrant accumulation of ribonucleotides in the genome causes various cellular abnormalities. Here, we show the possible role of human nucleotide excision repair (NER) and DNA polymerase η (Pol η) in processing of a single ribonucleotide embedded into DNA. We found that the reconstituted NER system can excise the oxidized ribonucleotide on the plasmid DNA. Taken together with the evidence that Pol η accurately bypasses a ribonucleotide, i.e., riboguanosine (rG) or its oxidized derivative (8-oxo-rG) in vitro , we further assessed the mutagenic potential of the embedded ribonucleotide in human cells lacking NER or Pol η. A single rG on the supF reporter gene predominantly induced large deletion mutations. An embedded 8-oxo-rG caused base substitution mutations at the 3’-neighboring base rather than large deletions in wild-type cells. The disruption of XPA , an essential factor for NER, or Pol η leads to the increased mutant frequency of 8-oxo-rG. Furthermore, the frequency of 8-oxo-rG-mediated large deletions was increased by the loss of Pol η, but not XPA. Collectively, our results suggest that base oxidation of the embedded ribonucleotide enables processing of the ribonucleotide via alternative DNA repair and damage tolerance pathways.

Abstract ICE KKS102 Tn 4677 , which has been shown to transfer horizontally, carries bph operon for mineralization of PCBs/biphenyl and belongs to an ICE Tn 4371 family. In this study we investigated the role of traR gene encoding a LysR-type transcriptional regulator, which is conserved in sequence, positioning, and directional orientation among Tn 4371 family ICEs. The traR belonged to bph operon and its overexpression on solid medium resulted in modest upregulation of traG (3-fold) and marked upregulation of xis (80-fold), and enhanced ICE excision, and notably ICE transfer frequency. We propose the evolutional roles of traR , which upon insertion to the current position, connected the cargo gene activation and ICE-transfer. This property of ICE, transferring under environmental conditions that lead to cargo gene activation, would give fitness advantages to the host bacteria, thereby resulting in efficient dissemination of the Tn 4371 family ICEs. Significance Only ICE KKS102 Tn 4677 is proven to transfer among the widely disseminating Tn 4371 family ICEs from β and γ-proteobacteria. We showed that the traR gene in ICE KKS102 Tn 4677 conserved in the ICE family with fixed location and direction is co-transcribed with the cargo gene and activates ICE transfer. We propose that capturing of traR by an ancestral ICE to the current position established ICE Tn 4371 family ICEs. Our findings provide insights into the evolutionary processes that led to the widespread distribution of the Tn 4371 family of ICEs across bacterial species.