The use of peptide–human histocompatibility leukocyte antigen (HLA) class I tetrameric complexes to identify antigen-specific CD8+ T cells has provided a major development in our understanding of their role in controlling viral infections. However, questions remain about the exact function of these cells, particularly in HIV infection. Virus-specific cytotoxic T lymphocytes exert much of their activity by secreting soluble factors such as cytokines and chemokines. We describe here a method that combines the use of tetramers and intracellular staining to examine the functional heterogeneity of antigen-specific CD8+ T cells ex vivo. After stimulation by specific peptide antigen, secretion of interferon (IFN)-γ, tumor necrosis factor (TNF)-α, macrophage inflammatory protein (MIP)-1β, and perforin is analyzed by FACS® within the tetramer-positive population in peripheral blood. Using this method, we have assessed the functional phenotype of HIV-specific CD8+ T cells compared with cytomegalovirus (CMV)-specific CD8+ T cells in HIV chronic infection. We show that the majority of circulating CD8+ T cells specific for CMV and HIV antigens are functionally active with regards to the secretion of antiviral cytokines in response to antigen, although a subset of tetramer-staining cells was identified that secretes IFN-γ and MIP-1β but not TNF-α. However, a striking finding is that HIV-specific CD8+ T cells express significantly lower levels of perforin than CMV-specific CD8+ T cells. This lack of perforin is linked with persistent CD27 expression on HIV-specific cells, suggesting impaired maturation, and specific lysis ex vivo is lower for HIV-specific compared with CMV-specific cells from the same donor. Thus, HIV-specific CD8+ T cells are impaired in cytolytic activity.

Hepatitis B virus (HBV) is a noncytopathic virus, and the recognition of infected hepatocytes by HBV-specific CD8 cells has been assumed to be the central mechanism causing both liver damage and virus control. To understand the role of cytotoxic T cells in the pathogenesis of HBV infection, we used functional assays that require T cell expansion in vitro and human histocompatibility leukocyte antigen (HLA)-peptide tetramers that allow direct ex vivo quantification of circulating and liver-infiltrating HBV-specific CD8 cells. Two groups of patients with persistent HBV infection were studied: one without liver inflammation and HBV replication, the other with liver inflammation and a high level of HBV replication. Contrary to expectation, a high frequency of intrahepatic HBV-specific CD8 cells was found in the absence of hepatic immunopathology. In contrast, virus-specific T cells were more diluted among liver infiltrates in viremic patients, but their absolute number was similar because of the massive cellular infiltration. Furthermore, inhibition of HBV replication was associated with the presence of a circulating reservoir of CD8+ cells able to expand after specific virus recognition that was not detectable in highly viremic patients with liver inflammation. These results show that in the presence of an effective HBV-specific CD8 response, inhibition of virus replication can be independent of liver damage. When the HBV-specific CD8 response is unable to control virus replication, it may contribute to liver pathology not only directly but by causing the recruitment of nonvirus-specific T cells.

Abstract Canine circovirus (CanineCV) has a worldwide distribution in dogs and is occasionally detected in wild carnivorans, indicating its ability for cross-species transmission. However, fox circovirus, a subclade of CanineCV, has been identified exclusively in wild canids. We analyzed spleen samples from 159 grey wolves from the Northwest Territories, Canada, to investigate the molecular epidemiology of CanineCV and formulate hypotheses about virus ecology and evolution. Overall, 72 (45.3%) animals tested positive. Virus prevalence was similar between males and females, adults and juveniles, and across the investigated years and locations. CanineCV infection was not associated with a poor body condition. While the percentage of co-infections with canine parvoviruses, investigated in a previous study, was high (63/72, 87.5%), the rate of parvovirus infection in CanineCV-negative animals was significantly lower (48.3%, p < 0.001) and CanineCV infection was associated with a 7.5- and 2.4-fold increase in the risk of acquiring canine parvovirus 2 or canine bufavirus infections, respectively (odds ratios: 3.5-16.9 and 1.3-5.8). Although common risk factors cannot be ruled out, this suggests that CanineCV may facilitate parvoviral super-infections. Sequencing revealed high genetic diversity, further exacerbated by recombination. Of the 69 sequenced strains, 87.5% were fox circoviruses, five were related to a fox circovirus-like recombinant strain, and one belonged to a distant clade. In the phylogenetic analysis, the viruses were distributed according to sampling locations, with some viruses being geographically restricted. Different clades of viruses were identified in the same areas and over multiple years (2007-2019), indicating the co-existence of multiple endemic lineages. Phylogenetic analysis of all available complete fox circovirus genomes (32 from foxes and 15 from wolves from North America and Europe) demonstrated four lineages, each including sequences from this study. Within each lineage, strains segregated geographically and not by host. This implies that, although multiple lineages co-exist, viruses do not frequently move between locations. Finally, viruses from Europe and North America were mixed, indicating that the origin of the four lineages might predate the segregation of European and American wolf and fox populations. Given the high prevalence and diversity of fox circoviruses in wolves, these animals should be considered reservoir hosts for these viruses. Although we cannot exclude a lower susceptibility of dogs, the lack of fox circovirus in dogs could be due to environmental circumstances that prevented its spread to dogs. Given the high diversity and wild host specificity, we presume a long-lasting association between fox circovirus and canine hosts and hypothesize a higher likelihood of transmission from dogs to wild animals than vice versa. Further studies should investigate other sympatric wild species and additional locations to explore the reasons behind the marked difference in cross-species transmission dynamics among the various clades.