Toxins of toxin-antitoxin systems use diverse mechanisms to control bacterial growth and represent attractive therapeutic targets to fight pathogens. In this study, we characterized the translation inhibitor toxin MenT3 of Mycobacterium tuberculosis, the bacterium responsible for human tuberculosis in humans. We show that MenT3 is a robust cytidine specific tRNA nucleotidyltransferase in vitro, capable of modifying the aminoacyl acceptor ends of most tRNA but with a marked preference for tRNASer, to which long stretches of cytidines were added. Furthermore, transcriptomic-wide analysis of MenT3 targets in M. tuberculosis identified tRNASer as the sole target of MenT3 in vivo and revealed significant detoxification attempts by ribonuclease PH in response to MenT3 overexpression. Finally, under physiological conditions, only in the presence the native menAT3 operon, we found the unexpected presence of an active pool of endogenous MenT3 targeting tRNASer in M. tuberculosis, likely reflecting the importance of MenT3 during infection.

Abstract Nucleotidyltransferases (NTases) control diverse physiological processes, including RNA modification, DNA replication and repair, and antibiotic resistance. The Mycobacterium tuberculosis NTase toxin family, MenT, modifies tRNAs to block translation. MenT toxin activity can be stringently regulated by diverse MenA antitoxins. There has been no unifying mechanism linking antitoxicity across MenT homologues. Here we demonstrate through structural, biochemical, biophysical and computational studies that despite lacking kinase motifs, antitoxin MenA 1 induces auto-phosphorylation of MenT 1 by repositioning the MenT 1 phosphoacceptor T39 active site residue towards bound nucleotide. Finally, we expand this predictive model to explain how unrelated antitoxin MenA 3 is similarly able to induce auto-phosphorylation of cognate toxin MenT 3 . Our study reveals a conserved mechanism for the control of tuberculosis toxins, and demonstrates how active site auto-phosphorylation can regulate the activity of widespread NTases.

Abstract Toxins of toxin-antitoxin systems use diverse mechanisms to inhibit bacterial growth. In this study, we characterize the translation inhibitor toxin MenT3 of Mycobacterium tuberculosis , the bacterium responsible for tuberculosis in humans. We show that MenT3 is a robust cytidine specific tRNA nucleotidyltransferase in vitro, capable of modifying the aminoacyl acceptor ends of most tRNA but with a marked preference for tRNA Ser , to which long stretches of cytidines are added. Furthermore, transcriptomic-wide analysis of MenT3 targets in M. tuberculosis identifies tRNA Ser as the sole target of MenT3 and reveals significant detoxification attempts by the essential CCA-adding enzyme PcnA in response to MenT3. Finally, under physiological conditions, only in the presence the native menAT3 operon, an active pool of endogenous MenT3 targeting tRNA Ser in M. tuberculosis is detected, likely reflecting the importance of MenT3 during infection.