The top-down approach to proteomics offers compelling advantages due to the potential to provide complete characterization of protein sequence and post-translational modifications. Here we describe the implementation of 193 nm ultraviolet photodissociation (UVPD) in an Orbitrap mass spectrometer for characterization of intact proteins. Near-complete fragmentation of proteins up to 29 kDa is achieved with UVPD including the unambiguous localization of a single residue mutation and several protein modifications on Pin1 (Q13526), a protein implicated in the development of Alzheimer’s disease and in cancer pathogenesis. The 5 ns, high-energy activation afforded by UVPD exhibits far less precursor ion-charge state dependence than conventional collision- and electron-based dissociation methods.

We illustrate the utility of native mass spectrometry (nMS) combined with a fast, tunable gas-phase charge reduction, electron capture charge reduction (ECCR), for the characterization of protein complex topology and glycoprotein heterogeneity. ECCR efficiently reduces the charge states of tetradecameric GroEL, illustrating Orbitrap

We illustrate the utility of native mass spectrometry (nMS) combined with a fast, tunable gas-phase charge reduction, electron capture charge reduction (ECCR), for the characterization of protein complex topology and glycoprotein heterogeneity. ECCR efficiently reduces the charge states of tetradecameric GroEL, illustrating Orbitrap

Plants boost the expression of pseudo-enzyme PDX1.2 under heat stress and during embryonic development. PDX1.2 positively regulates vitamin B6 production by hetero-association with its active catalytic homologs such as PDX1.1 and PDX1.3. These heterologous interactions were found challenging to understand. For instance, the crystals of PDX1.2-PDX1.3 heterocomplexes were found to be statistically disordered and individual proteins could not be assigned. Using a combination of biochemical and structural tools, we find that the key to this phenomenon is the nature of PDX1.2 hetero-assembly with its catalytic counterparts. Using a cell-free protein synthesis approach, we were able to set up a precise control of co-expression where we systematically varied the ratios of co-produced proteins by tuning the ratios of input DNA. These were further analyzed by Native Mass Spectrometry, which elucidated that 6-8 hetero-complex species of dodecamers of variable stoichiometry are produced for each co-expression condition tested. This is in contrast to previous hypothesis of stacked inter-hexamer assembly mechanism. As proposed previously, our high-resolution Cryo-EM structure of pseudo-enzyme PDX1.2 closely mimics the fold of PDX1.3 and maintains all necessary protein-protein interactions between subunits. In PDX1.2, the altered catalytic site P1 appears perturbed in concordance with its lack of activity, while the P2 site appears largely unchanged. The most surprising finding is that we observe a complete switch in the surface electrostatics for PDX1.2. Based on the activity assays and its structure, we hypothesize that the change in electrostatic would have a significant impact on the neighboring P2 site of the PDX1.3 and influence the turnover efficiency at that site. These data suggest that pseudo-enzyme PDX1.2 rather acts as an electrostatic tuning module, that, in combination with its hetero-assembly mechanism based on random incorporation, imposes a perfect regulatory control of such important process.

NCR044.1 is a 36-amino acid nodule-specific cysteine-rich antimicrobial peptide expressed in the developing nodules of Medicago truncatula. Here, we determined its unique NMR structure to be largely disordered, one four-residue α-helix and one three-residue anti-parallel β-sheet stabilized by two disulfide bonds, suggesting it is highly dynamic. NCR044.1 exhibited potent fungicidal activity against multiple plant fungal pathogens. It breached the fungal plasma membrane, bound to multiple phosphoinositides, and induced reactive oxygen species. Time-lapse confocal and super-resolution microscopy revealed strong fungal cell wall binding, penetration of the cell membrane at discrete foci, followed by gradual loss of turgor, and subsequent accumulation in the cytoplasm with elevated levels in nucleoli. Nucleolar localization of NCR044.1 was unique amongst plant antifungal peptides, suggesting its potential interaction with ribosomes and inhibition of translation. Spray-applied NCR044.1 significantly reduced gray mold disease symptoms caused by the fungal pathogen Botrytis cinerea in tomato plants and post-harvest products demonstrating its potential as a spray-on peptide-based biofungicide.