Interleukin 10 (IL-10) and viral IL-10 (v-IL-10) strongly reduced antigen-specific proliferation of human T cells and CD4+ T cell clones when monocytes were used as antigen-presenting cells. In contrast, IL-10 and v-IL-10 did not affect the proliferative responses to antigens presented by autologous Epstein-Barr virus-lymphoblastoid cell line (EBV-LCL). Inhibition of antigen-specific T cell responses was associated with downregulation of constitutive, as well as interferon gamma- or IL-4-induced, class II MHC expression on monocytes by IL-10 and v-IL-10, resulting in the reduction in antigen-presenting capacity of these cells. In contrast, IL-10 and v-IL-10 had no effect on class II major histocompatibility complex (MHC) expression on EBV-LCL. The reduced antigen-presenting capacity of monocytes correlated with a decreased capacity to mobilize intracellular Ca2+ in the responder T cell clones. The diminished antigen-presenting capacities of monocytes were not due to inhibitory effects of IL-10 and v-IL-10 on antigen processing, since the proliferative T cell responses to antigenic peptides, which did not require processing, were equally well inhibited. Furthermore, the inhibitory effects of IL-10 and v-IL-10 on antigen-specific proliferative T cell responses could not be neutralized by exogenous IL-2 or IL-4. Although IL-10 and v-IL-10 suppressed IL-1 alpha, IL-1 beta, tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha), and IL-6 production by monocytes, it was excluded that these cytokines played a role in antigen-specific T cell proliferation, since normal antigen-specific responses were observed in the presence of neutralizing anti-IL-1, -IL-6, and -TNF-alpha mAbs. Furthermore, addition of saturating concentrations of IL-1 alpha, IL-1 beta, IL-6, and TNF-alpha to the cultures had no effect on the reduced proliferative T cell responses in the presence of IL-10, or v-IL-10. Collectively, our data indicate that IL-10 and v-IL-10 can completely prevent antigen-specific T cell proliferation by inhibition of the antigen-presenting capacity of monocytes through downregulation of class II MHC antigens on monocytes.

Hematopoietic stem cell (HSC) gene therapy for adenosine deaminase (ADA)-deficient severe combined immunodeficiency (SCID) has shown limited clinical efficacy because of the small proportion of engrafted genetically corrected HSCs. We describe an improved protocol for gene transfer into HSCs associated with nonmyeloablative conditioning. This protocol was used in two patients for whom enzyme replacement therapy was not available, which allowed the effect of gene therapy alone to be evaluated. Sustained engraftment of engineered HSCs with differentiation into multiple lineages resulted in increased lymphocyte counts, improved immune functions (including antigen-specific responses), and lower toxic metabolites. Both patients are currently at home and clinically well, with normal growth and development. These results indicate the safety and efficacy of HSC gene therapy combined with nonmyeloablative conditioning for the treatment of SCID.

Next-Generation Gene Therapy Few disciplines in contemporary clinical research have experienced the high expectations directed at the gene therapy field. However, gene therapy has been challenging to translate to the clinic, often because the therapeutic gene is expressed at insufficient levels in the patient or because the gene delivery vector integrates near protooncogenes, which can cause leukemia (see the Perspective by Verma ). Biffi et al. ( 1233158 , published online 11 July) and Aiuti et al. ( 1233151 ; published online 11 July) report progress on both fronts in gene therapy trials of three patients with metachromatic leukodystrophy (MLD), a neurodegenerative disorder, and three patients with Wiskott-Aldrich syndrome (WAS), an immunodeficiency disorder. Optimized lentiviral vectors were used to introduce functional MLD or WAS genes into the patients' hematopoietic stem cells (HSCs) ex vivo, and the transduced cells were then infused back into the patients, who were then monitored for up to 2 years. In both trials, the patients showed stable engraftment of the transduced HSC and high expression levels of functional MLD or WAS genes. Encouragingly, there was no evidence of lentiviral vector integration near proto-oncogenes, and the gene therapy treatment halted disease progression in most patients. A longer follow-up period will be needed to further validate efficacy and safety.

Abstract Rapamycin is an immunosuppressive compound that is currently used to prevent acute graft rejection in humans. In addition, rapamycin has been shown to allow operational tolerance in murine models. However, a direct effect of rapamycin on T regulatory (Tr) cells, which play a key role in induction and maintenance of peripheral tolerance, has not been demonstrated so far. Here, we provide new evidence that rapamycin selectively expands the murine naturally occurring CD4+CD25+FoxP3+ Tr cells in vitro. These expanded Tr cells suppress proliferation of syngeneic T cells in vitro and prevent allograft rejection in vivo. Interestingly, rapamycin does not block activation-induced cell death and proliferation of CD4+ T cells in vitro. Based on this new mode of action, rapamycin can be used to expand CD4+CD25+FoxP3+ Tr cells for ex vivo cellular therapy in T-cell-mediated diseases. (Blood. 2005;105:4743-4748)

Active suppression by T regulatory (Tr) cells plays an important role in the downregulation of T cell responses to foreign and self-antigens. Mouse CD4(+) Tr cells that express CD25 possess remarkable suppressive activity in vitro and in autoimmune disease models in vivo. Thus far, the existence of a similar subset of CD25(+)CD4(+) Tr cells in humans has not been reported. Here we show that human CD25(+)CD4(+) Tr cells isolated from peripheral blood failed to proliferate and displayed reduced expression of CD40 ligand (CD40L), in response to T cell receptor-mediated polyclonal activation, but strongly upregulated cytotoxic T lymphocyte-associated antigen (CTLA)-4. Human CD25(+)CD4(+) Tr cells also did not proliferate in response to allogeneic antigen-presenting cells, but they produced interleukin (IL)-10, transforming growth factor (TGF)-beta, low levels of interferon (IFN)-gamma, and no IL-4 or IL-2. Importantly, CD25(+)CD4(+) Tr cells strongly inhibited the proliferative responses of both naive and memory CD4(+) T cells to alloantigens, but neither IL-10, TGF-beta, nor CTLA-4 seemed to be directly required for their suppressive effects. CD25(+)CD4(+) Tr cells could be expanded in vitro in the presence of IL-2 and allogeneic feeder cells and maintained their suppressive capacities. These findings that CD25(+)CD4(+) Tr cells with immunosuppressive effects can be isolated from peripheral blood and expanded in vitro without loss of function represent a major advance towards the therapeutic use of these cells in T cell-mediated diseases.

Forkhead box P3 (FOXP3) is currently thought to be the most specific marker for naturally occurring CD4+CD25+ T regulatory cells (nTregs). In mice, expression of FoxP3 is strictly correlated with regulatory activity, whereas increasing evidence suggests that in humans, activated T effector cells (Teffs) may also express FOXP3. In order to better define the role of FOXP3 in human Teff cells, we investigated the intensity and kinetics of expression in ex vivo Teff cells, suppressed Teff cells and Teff cell lines. We found that all dividing Teff cells expressed FOXP3, but only transiently, and at levels that were significantly lower than those in suppressive nTregs. This temporary expression in Teff cells was insufficient to suppress expression of reported targets of FOXP3 repressor activity, including CD127, IL-2 and IFN-γ, and was not correlated with induction of a nTreg phenotype. Thus expression of FOXP3 is a normal consequence of CD4+ T cell activation and, in humans, it can no longer be used as an exclusive marker of nTregs. These data indicate that our current understanding of how FOXP3 contributes to immune tolerance in humans needs to be re-evaluated.

CD4+CD25+FOXP3+ T regulatory cells (Tregs) are pivotal for the induction and maintenance of peripheral tolerance in both mice and humans. Rapamycin has been shown to promote tolerance in experimental models and to favor CD4+CD25+ Treg-dependent suppression. We recently reported that rapamycin allows in vitro expansion of murine CD4+CD25+FoxP3+ Tregs, which preserve their suppressive function. In the current study, we show that activation of human CD4+ T cells from healthy subjects in the presence of rapamycin leads to growth of CD4+CD25+FOXP3+ Tregs and to selective depletion of CD4+CD25- T effector cells, which are highly sensitive to the antiproliferative effect of the compound. The rapamycin-expanded Tregs suppress proliferation of both syngeneic and allogeneic CD4+ and CD8+ T cells. Interestingly, rapamycin promotes expansion of functional CD4+CD25+FOXP3+ Tregs also in type 1 diabetic patients, in whom a defect in freshly isolated CD4+CD25+ Tregs has been reported. The capacity of rapamycin to allow growth of functional CD4+CD25+FOXP3+ Tregs, but also to deplete T effector cells, can be exploited for the design of novel and safe in vitro protocols for cellular immunotherapy in T cell-mediated diseases.

Decades of work have aimed to genetically reprogram T cells for therapeutic purposes1,2 using recombinant viral vectors, which do not target transgenes to specific genomic sites3,4. The need for viral vectors has slowed down research and clinical use as their manufacturing and testing is lengthy and expensive. Genome editing brought the promise of specific and efficient insertion of large transgenes into target cells using homology-directed repair5,6. Here we developed a CRISPR–Cas9 genome-targeting system that does not require viral vectors, allowing rapid and efficient insertion of large DNA sequences (greater than one kilobase) at specific sites in the genomes of primary human T cells, while preserving cell viability and function. This permits individual or multiplexed modification of endogenous genes. First, we applied this strategy to correct a pathogenic IL2RA mutation in cells from patients with monogenic autoimmune disease, and demonstrate improved signalling function. Second, we replaced the endogenous T cell receptor (TCR) locus with a new TCR that redirected T cells to a cancer antigen. The resulting TCR-engineered T cells specifically recognized tumour antigens and mounted productive anti-tumour cell responses in vitro and in vivo. Together, these studies provide preclinical evidence that non-viral genome targeting can enable rapid and flexible experimental manipulation and therapeutic engineering of primary human immune cells. A non-viral strategy to introduce large DNA sequences into T cells enables the correction of a pathogenic mutation that causes autoimmunity, and the replacement of an endogenous T-cell receptor with an engineered receptor that can recognize cancer antigens.