Abstract The discovery and development of novel antiseizure drugs (ASDs) that are effective in controlling pharmacoresistant spontaneous recurrent seizures (SRSs) continues to represent a significant unmet clinical need. The Epilepsy Therapy Screening Program (ETSP) has undertaken efforts to address this need by adopting animal models that represent the salient features of human pharmacoresistant epilepsy and employing these models for preclinical testing of investigational ASDs. One such model that has garnered increased interest in recent years is the mouse variant of the Intra-Amygdala Kainate (IAK) microinjection model of mesial temporal lobe epilepsy (MTLE). In establishing a version of this model, several methodological variables were evaluated for their effect(s) on pertinent quantitative endpoints. Although administration of a benzodiazepine 40 minutes after kainate (KA) induced status epilepticus (SE) is commonly used to improve survival, data presented here demonstrates similar outcomes (mortality, hippocampal damage, latency periods, and 90-day SRS natural history) between mice given midazolam and those that were not. Using a version of this model that did not interrupt SE with a benzodiazepine, a 90-day natural history study was performed and survival, latency periods, SRS frequencies and durations, and SRS clustering data were quantified. Finally, an important step towards model adoption is to assess the sensitivities or resistances of SRSs to a panel of approved and clinically used ASDs. Accordingly, the following ASDs were evaluated for their effects on SRSs in these mice: phenytoin (20 mg/kg, b.i.d.), carbamazepine (30 mg/kg, t.i.d.), valproate (240 mg/kg, t.i.d.), diazepam (4 mg/kg, b.i.d.), and phenobarbital (25 and 50 mg/kg, b.i.d.). Valproate, diazepam, and phenobarbital significantly attenuated SRS frequency relative to vehicle controls at doses devoid of observable adverse behavioral effects. Only diazepam significantly increased seizure freedom. Neither phenytoin nor carbamazepine significantly altered SRS frequency or freedom under these experimental conditions. These data demonstrate that SRSs in this IAK model of MTLE are pharmacoresistant to two representative sodium channel-inhibiting ASDs (phenytoin and carbamazepine) but not to GABA receptor modulating ASDs (diazepam and phenobarbital) or a mixed-mechanism ASD (valproate). Accordingly, this model is being incorporated into the NINDS-funded ETSP testing platform for treatment resistant epilepsy. Highlights An intra-amygdala kainate model of TLE was evaluated for pharmacoresistant seizures Administration of midazolam during status epilepticus did not affect mortality Model characteristics were evaluated over a 90-day natural history study Spontaneous seizures were resistant to phenytoin and carbamazepine Spontaneous seizures were sensitive to valproic acid, diazepam, and phenobarbital

Summary Objective The kainic acid (KA)-induced status epilepticus (SE) model in rats is an etiologically-relevant animal model of epileptogenesis. Just as in patients, who develop temporal lobe epilepsy (TLE) following SE, this rat model of KA-induced SE very closely recapitulates many of the clinical and pathological characteristics of human TLE that arise following SE or another neurological insult. Spontaneous recurrent seizures (SRS) in TLE can present after a latent period following a neurological insult (TBI, SE event, viral infection, etc.). Moreover, this rat model of TLE is ideally suited for preclinical studies to evaluate the long-term process of epileptogenesis and screen putative disease-modifying/antiepileptogenic agents. This report details the pharmacological characterization and methodological refinement of a moderate-throughput drug screening program using the post KA-induced SE model of epileptogenesis in male Sprague Dawley rats to identify potential agents that may prevent or modify the onset or severity of SRS. Specifically, we sought to demonstrate whether our protocol could prevent the development of SRS, or lead to a reduced frequency/severity of SRS. Methods Rats were administered everolimus (2-3 mg/kg, P.O. commencing at 1, 2, or 24-hrs after SE onset) or phenobarbital (60 mg/kg, beginning 1 hr after SE onset). The rats in all studies (n=12/treatment dose/study) were then followed intermittently by video-EEG monitoring; i.e., 2-weeks on/2-weeks off, 2-weeks on epochs to determine latency to onset of SRS, and disease burden following SRS onset. Results While there were no adverse side effects observed in any of our studies, no treatment conferred a significant disease modifying effect, nor did any agent prevent the presentation of SRS by 6 weeks post-SE onset. Conclusions While neither phenobarbital nor everolimus administered at several time points post-SE onset prevented the development of SRS, we herein demonstrate a moderate-throughput screen for potential antiepileptogenic agents in an etiologically-relevant rodent model of TLE. Key Points Disease-modifying therapies are needed to prevent or attenuate the burden of epilepsy in at-risk individuals. We report a moderate-throughput screening protocol to identify disease-modifying agents in a rat post-kainic acid status epilepticus model. Everolimus was administered at multiple time points post-status epilepticus with no effect on spontaneous seizures up to 6 weeks later. Repeated administration of phenobarbital also did not prevent the development of spontaneous recurrent seizures up to 6 weeks post SE. While we did not identify any effect of either agent, our approach provides a moderate-throughput screen for antiepileptogenesis.

Abstract Dravet syndrome (DS) is a rare childhood epilepsy disorder resulting in spontaneous, recurrent seizures (SRS) and behavioral co-morbidities. To facilitate the discovery and development of anti-seizure drugs for DS, the contract site of the NINDS Epilepsy Therapy Screening Program (ETSP) has continued to evaluate a mouse model of DS. Scn1a A1783V/WT mice exhibited increased hyperactivity, thigmotaxis, and deficits in nest-building behavior. Ex-vivo brain slice electrophysiology experiments revealed increased excitability of hippocampal CA1 neurons specifically due to increased action potential firing frequency in response to brief depolarizations and decreased frequency of spontaneous GABAergic synaptic events. A video-EEG study revealed mice had on average, 1 seizure per day, with males seizing significantly more frequently than females. Increased proportion of seizure activity occurred during the dark phase of the light/dark cycle in both sexes. While clobazam, a drug commonly prescribed to patients with DS, had no effect on SRS activity at the tested doses, the seizure history and frequency observed in this study aids in determining the sample sizes and experimental timeline needed for adequately powered preclinical drug studies. Overall, this study provides a broad description of the Scn1a A1783V/WT mouse and highlights the utility of this model in therapy discovery.

Abstract Background Patients with drug-resistant epilepsy, including Dravet syndrome (DS), are frequently prescribed multiple antiseizure medications (ASMs). Nevertheless, people with DS often have inadequate seizure control, and there is an ongoing unmet clinical need to identify novel therapeutics. As a proof-of-principle study to further validate and characterize the Scn1a A1783V/WT mouse model and identify a drug screening paradigm with face, construct, and predictive value, we assessed the efficacy of subchronic administration of stiripentol add-on to clobazam and valproic acid at clinically relevant doses using the Scn1a A1783V/WT mouse model. Methods We evaluated the efficacy of STP add-on to CLB and VPA using hyperthermia-induced and video-EEG monitoring of spontaneous seizure tests following a 14-day treatment. VPA was delivered via osmotic minipump, while STP and CLB were administered via food pellets delivered through automatic feeders. Bioanalytical assays were performed to evaluate drug concentrations in plasma and brain using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Results STP, CLB, N-desmethylclobazam, and VPA all yielded plasma concentrations within the human therapeutic plasma concentrations range. STP added to CLB and VPA significantly elevated the seizing temperatures in the hyperthermia-induced seizure assay. CLB, VPA, and STP coadministration significantly reduced spontaneous seizure frequency compared to CLB and VPA combined. Significance This research lays the groundwork for exploring effective add-on compounds to CLB and VPA in treating DS. The study further highlights the utility of the Scn1a A1783V/WT mice in discovering therapies for DS-associated pharmacoresistant seizures. Key points Integrating pharmacokinetic studies to guide the selection of doses in preclinical studies to achieve target concentrations comparable to the human therapeutic range is crucial in successfully translating animal drug development studies to clinical use. STP add-on to CLB and VPA significantly reduced spontaneous seizure frequency in Scn1a A1783V/WT mice. A triple-drug polytherapy approach that mimics the clinical treatment paradigm will be an essential preclinical drug screening strategy for identifying novel investigational compounds for Dravet syndrome.

Abstract Objective The current standard of care for Dravet Syndrome includes polytherapy after inadequate seizure control with one or more monotherapy approaches. Treatment guidelines are often based on expert opinions, and finding an optimal balance between seizure control and adverse drug effects can be challenging. This study utilizes efficacy and pharmacokinetic analysis of a second-line treatment regimen that combines clobazam and sodium valproate with an add-on drug as a proof-of-principle approach to establish an effective therapeutic regimen in a preclinical mouse model of Dravet Syndrome. Method We evaluated the efficacy of add-on therapies stiripentol, cannabidiol, lorcaserin, or fenfluramine to clobazam and sodium valproate against hyperthermia-induced seizures in Scn1a A1783V/WT mice. Clobazam, N-desmethyl clobazam (an active metabolite of clobazam), sodium valproate, stiripentol, and cannabidiol concentrations were quantified in plasma and brain using liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the combinations deemed effective against hyperthermia-induced seizures. The concentration data were used to calculate pharmacokinetic parameters via non-compartmental analysis in Phoenix WinNonLin. Results Higher doses of stiripentol or cannabidiol, in combination with clobazam and sodium valproate, were effective against hyperthermia-induced seizures in Scn1a A1783V/WT mice. In Scn1a WT/WT mice, brain clobazam and N-desmethyl clobazam concentrations were higher in the triple-drug combinations than in the clobazam monotherapy. Stiripentol and cannabidiol brain concentrations were greater in the triple-drug therapy than when given alone. Interpretation A polypharmacy strategy may be a practical preclinical approach to identifying efficacious compounds for Dravet Syndrome. The drug-drug interactions between compounds used in this study may explain the potentiated efficacy of some combination therapies. Graphical Abstract Key findings The hyperthermia-induced seizure assay in Scn1a A1783V/WT mice can identify efficacious antiseizure medications. A triple-drug administration paradigm was designed that mimics clinical standards for add-on therapies in DS. Stiripentol and cannabidiol were effective against hyperthermia-induced seizures when co-administered with clobazam and sodium valproate. Potential drug-drug interactions between compounds may explain the potentiated antiseizure effect in triple-drug therapies. The triple-drug “add-on” therapy approach may be a valuable preclinical strategy for screening investigational compounds for DS, an assay offered at the ETSP.

Abstract Objective High-intensity magnetic resonance-guided focused ultrasound (MRgFUS) is a noninvasive therapy to lesion brain tissue, used clinically in patients and preclinically in several animal models. Challenges with focused ablation in rodent brains can include skull and near-field heating and accurately targeting small and deep brain structures. We overcame these challenges by creating a novel method consisting of a craniectomy skull preparation, a high-frequency transducer (3 MHz) with a small ultrasound focal spot, a transducer positioning system with an added manual adjustment of ∼0.1 mm targeting accuracy, and MR acoustic radiation force imaging for confirmation of focal spot placement. Methods The study consisted of two main parts. First, two skull preparation approaches were compared. A skull thinning approach (n=7 lesions) was compared to a craniectomy approach (n=22 lesions), which confirmed a craniectomy was necessary to decrease skull and near-field heating. Second, the two transducer positioning systems were compared with the fornix chosen as a subcortical ablation target. We evaluated the accuracy of targeting using a high-frequency transducer with a small ultrasound focal spot and MR acoustic radiation force imaging. Results Comparing a motorized adjustment system (∼1 mm precision, n=17 lesions) to the motorized system with an added micromanipulator (∼0.1 mm precision, n=14 lesions), we saw an increase in the accuracy of targeting the fornix by 133%. The described work allows for repeatable and accurate targeting of small and deep structures in the rodent brain, such as the fornix, enabling the investigation of neurological disorders in chronic disease models.

Summary Objective Dravet syndrome (DS) is a rare, but catastrophic genetic epilepsy, with 80% of patients with carrying a mutation in the SCN1A gene. Currently, no anti-seizure drug (ASD) exists that adequately controls seizures. Patients with DS often present clinically with a febrile seizure and generalized tonic-clonic seizures that continue throughout life. To facilitate the development of ASDs for DS, the contract site of the NINDS Epilepsy Therapy Screening Program (ETSP) has evaluated a mouse model of DS using the conditional knock-in Scn1a A1783V/WT mouse. Methods Survival rates and temperature thresholds for Scn1a A1783V/WT were determined. Prototype ASDs were administered via intraperitoneal injections at the time-to-peak effect, which was previously determined, prior to the induction of hyperthermia-induced seizures. Protection was determined if ASDs significantly increased the temperature at which Scn1a A1783V/WT mice seized. Results Approximately 50% of Scn1a A1783V/WT survive to adulthood and all have hyperthermia-induce seizures. The results suggest that hyperthermia-induced seizures in this model of DS are highly refractory to a battery of ASDs. Exceptions were clobazam, tiagabine, and the combination of clobazam and valproic acid with add-on stiripentol, which elevated seizure thresholds Significance Overall, the data demonstrate the proposed model for DS is suitable for screening novel compounds for the ability to block hyperthermia-induced seizures and heterozygous mice can be evaluated repeatedly over the course of several weeks, allowing for higher throughput screening. Key Points Scn1a A1783V/WT mice have a 50% survival rate and all have hyperthermia-induced seizures. Common DS treatments such as CLB and combinatorial therapy of CLB, VPA, and STP increase temperature thresholds in Scn1a A1783V/WT mice. Sodium channel blockers, such as CBZ and LTG, decrease temperature thresholds of Scn1a A1783V/WT mice as predicted. S cn1a A1783V/WT mice are highly pharmacoresitant to common ASDs The Scn1a A1783V/WT may be a useful preclinical drug screening platform for the treatment of DS.

Abstract Microglia are highly adaptable innate immune cells that rapidly respond to damage signals in the brain through adoption of a reactive phenotype and production of defensive inflammatory cytokines. Microglia express a distinct transcriptome, encoding receptors that allow them to dynamically respond to pathogens, damage signals, and cellular debris. Expression of one such receptor, the microglia-specific purinergic receptor P2ry12 , is known to be downregulated in reactive microglia. Here, we explore the microglial response to purinergic damage signals in reactive microglia in the TMEV mouse model of viral brain infection and temporal lobe epilepsy. Using two-photon calcium imaging in acute hippocampal brain slices, we found that the ability of microglia to detect damage signals, engage calcium signaling pathways, and chemoattract towards laser-induced tissue damage was dramatically reduced during the peak period of seizures, cytokine production, and infection. Using combined RNAscope in situ hybridization and immunohistochemistry, we found that during this same stage of heightened infection and seizures, microglial P2ry12 expression was reduced, while the pro-inflammatory cytokine TNF-a expression was upregulated in microglia, suggesting that the depressed ability of microglia to respond to new damage signals via P2ry12 occurs during the time when local elevated cytokine production contributes to seizure generation following infection. Therefore, changes in microglial purinergic receptors during infection likely limit the ability of reactive microglia to respond to new threats in the CNS and locally contain the scale of the innate immune response in the brain.

Abstract Transcranial focused ultrasound (FUS) may be a promising neuromodulation technology for treating people with epilepsy whose seizures are drug resistant. Prior studies have shown seizure suppression in animal studies using FUS. However, most of these studies were performed in evoked seizure models and not in animal models of epilepsy. Evoked seizure models do not exhibit the pathophysiology of epilepsy and do not exhibit spontaneous recurrent seizures, which define epilepsy. For translation to humans, there is a critical need to determine the specific FUS stimulation parameters that reduce spontaneous recurrent seizures in a chronic disease model of epilepsy. To achieve this goal, we developed and optimized an approach to determine the effects of ultrasonic stimulation on metrics of seizure-like events (SLEs) in awake, head-fixed mice within the intrahippocampal kainate (IHK) mouse model of temporal lobe epilepsy (TLE). A proof-of-principle study demonstrated that two target (bilateral and contralateral to the kainic acid injection site) stimulation conditions and two FUS parameter sets (low and high pressure) could be combined with the ability to simultaneously record hippocampal electroencephalograms. We also provide a method for analysis of the effects of FUS stimulation on the metrics of SLEs (interevent duration, SLE duration, and spike frequency).