Mutational hotspots indicate selective pressure across a population of tumor samples, but their prevalence within and across cancer types is incompletely characterized. An approach to detect significantly mutated residues, rather than methods that identify recurrently mutated genes, may uncover new biologically and therapeutically relevant driver mutations. Here, we developed a statistical algorithm to identify recurrently mutated residues in tumor samples. We applied the algorithm to 11,119 human tumors, spanning 41 cancer types, and identified 470 somatic substitution hotspots in 275 genes. We find that half of all human tumors possess one or more mutational hotspots with widespread lineage-, position- and mutant allele-specific differences, many of which are likely functional. In total, 243 hotspots were novel and appeared to affect a broad spectrum of molecular function, including hotspots at paralogous residues of Ras-related small GTPases RAC1 and RRAS2. Redefining hotspots at mutant amino acid resolution will help elucidate the allele-specific differences in their function and could have important therapeutic implications.

DNA methylation is an epigenetic modification involved in both normal developmental processes and disease states through the modulation of gene expression and the maintenance of genomic organization. Conventional methods of DNA methylation analysis, such as bisulfite sequencing, methylation sensitive restriction enzyme digestion and array-based detection techniques, have major limitations that impede high-throughput genome-wide analysis. We describe a novel technique, MBD-isolated Genome Sequencing (MiGS), which combines precipitation of methylated DNA by recombinant methyl-CpG binding domain of MBD2 protein and sequencing of the isolated DNA by a massively parallel sequencer. We utilized MiGS to study three isogenic cancer cell lines with varying degrees of DNA methylation. We successfully detected previously known methylated regions in these cells and identified hundreds of novel methylated regions. This technique is highly specific and sensitive and can be applied to any biological settings to identify differentially methylated regions at the genomic scale.

We used what is to our knowledge a new method to estimate volume loss after partial nephrectomy to assess the relative contributions of ischemic injury and volume loss on functional outcomes.We analyzed the records of 301 consecutive patients who underwent conventional partial nephrectomy between 2007 and 2010 with available data to meet inclusion criteria. Percent functional volume preservation was measured at a median of 1.4 years after surgery. Modification of diet in renal disease-2 estimated glomerular filtration rate was measured preoperatively and perioperatively, and a median of 1.2 years postoperatively. Statistical analysis was done to study associations.Hypothermia or warm ischemia 25 minutes or less was applied in 75% of cases. Median percent functional volume preservation was 91% (range 38%-107%). Percent glomerular filtration rate preservation at nadir and late time points was 77% and 90% of preoperative glomerular filtration rate, respectively. On multivariate analysis percent functional volume preservation and warm ischemia time were associated with nadir glomerular filtration rate while only percent functional volume preservation was associated with late glomerular filtration rate (each p <0.001). Late percent glomerular filtration rate preservation and percent functional volume preservation were directly associated (p <0.001). Recovery of function to 90% or greater of percent functional volume preservation predicted levels was observed in 86% of patients. In patients with de novo postoperative stage 3 or greater chronic kidney disease, percent functional volume preservation and Charlson score were associated with late percent glomerular filtration rate preservation. Warm ischemia time was not associated with late functional glomerular filtration rate decreases in patients considered high risk for ischemic injury.In this cohort volume loss and not ischemia time was the primary determinant of ultimate renal function after partial nephrectomy. Technical modifications aimed at minimizing volume loss during partial nephrectomy while still achieving negative margins may result in improved functional outcomes.

4605 Background: SCNEC-URO are rare aggressive cancers with limited treatments. Although they frequently co-exist (60-70%) with urothelial carcinoma (UC) at diagnosis, most metastatic biopsies of relapsing patients (pts) show pure small cell (SC) morphology. There are major unmet needs to predict relapse after definitive surgery. Methods: Data was extracted from a historical cohort of n=216 pts with surgery for surgically resectable disease (cT1-T4, N0 or N+, M0) at MD Anderson between November 1985 and June 2021. Morphology at resection was defined as: ‘pCR’ (pathological complete response, including no residual carcinoma or carcinoma in situ), ‘Any SCNEC’ (persistence of SC with UC in sample) or ‘Non-SCNEC’ (UC only). Relapse events after surgery were analyzed as time-to-event (TTE) outcome with competing risk non-parametric method. Univariable and multivariable analyses identified prognostic factors of relapse. Results: In TTE analysis, cohort events (n=216) included: n=70 censored (alive and relapse-free), n=92 failure events (with relapse), and n=54 competing events (death without known relapse). n=154 (71.3%) received neoadjuvant chemotherapy, including SCNEC regimens in 125/154 (81.2%) and UC regimens in 16/154 (10.4%). The 5-year cumulative incidence function (CIF) of relapse for all pts was 41.92% [95% CI: 35.2% - 48.5%]. CIF rates were significantly different per morphology at resection (Gray’s test, p<.0001). Pts with pCR had the lowest 5-year CIF rate for relapse (18.5%) [11.1% - 27.4%], while pts with ‘Any SCNEC’ had the highest CIF (69.6%) [58.6% - 78.9%]. Pts with Non-SCNEC had an intermediate CIF risk (31.6%) [17.6% - 46.7%]. Staging at resection also showed different CIF rates (Gray’s test, p<.0001). Pts with pT0N0 had the lowest CIF rate (12.8%) [5.6% - 23.2%], with CIF rates increasing with higher staging: pTisN0 (25%) [11.6% - 41%]; pT1N0 (25%) [5.4% - 51.7%]; pT2 or greater, but N0 (52.4%) [41% - 62.7%]. Pts staged node-positive (pN+) did not have an estimated 5-year CIF as most died within 5 years. In multivariable analysis, clinical staging at diagnosis, pathological staging and cellular morphology at resection were associated with relapse (Table). Conclusions: Besides staging at diagnosis and surgery, morphology at resection is a key predictor of relapse. Persistence of the SC component predicts a higher chance of relapse than its eradication and persistence of the UC component. While adjuvant therapy in UC has made significant progress recently, a tailored adjuvant approach addressing the residual SC component at definitive surgery is needed to improve outcomes and decrease relapse. [Table: see text]

Summary Tissue engineering offers a promising treatment strategy for ureteral strictures, but its success requires an in-depth understanding of the architecture, cellular heterogeneity, and signaling pathways underlying tissue regeneration. Here we define and spatially map cell populations within the human ureter using single-cell RNA sequencing, spatial gene expression, and immunofluorescence approaches. We focused on the stromal and urothelial cell populations to enumerate distinct cell types composing the human ureter and inferred potential cell-cell communication networks underpinning the bi-directional crosstalk between these compartments. Furthermore, we analyzed and experimentally validated the importance of Sonic Hedgehog (SHH) signaling pathway in adult stem cell maintenance. The SHH -expressing basal cells supported organoid generation in vitro and accurately predicted the differentiation trajectory from basal stem cells to terminally differentiated umbrella cells. Our results highlight essential processes involved in adult ureter tissue homeostasis and provide a blueprint for guiding ureter tissue engineering.

Introduction Nadofaragene firadenovec (Ad-IFNα/Syn3) is now approved for BCG-unresponsive bladder cancer (BLCA). IFNα is a pleiotropic cytokine that causes direct tumor cell killing via TRAIL-mediated apoptosis, angiogenesis inhibition, and activation of the innate and adaptive immune system. We established an immunocompetent murine BLCA model to study the effects of murine adenoviral IFNα (muAd-Ifnα) gene therapy on cancer cells and the tumor microenvironment using a novel murine equivalent of Nadofaragene firadenovec (muAd-Ifnα). Methods Tumors were induced by instilling MB49 cells into the bladders of mice; luciferase imaging confirmed tumor development. Mice were treated with adenovirus control (Ad-Ctrl; empty vector), or muAd-Ifnα (3x10 11 VP/mL), and survival analysis was performed. For single-cell sequencing (scRNAseq) analysis (72h), bladders were harvested and treated with collagenase/hyaluronidase and TrypLE for cell dissociation. Single cells were suspended in PBS/1% FBS buffer; viability was assessed with Vicell cell counter. scRNAseq analysis was performed using 10X genomics 3’ sequencing. Raw RNAseq data were pre-processed using Cell Ranger single-cell software. Seurat (R package) was used to normalize and cluster the scRNA data. Pooled differential gene expression analysis in specific cell clusters was performed with DESeq2. Results We identified 16 cell clusters based on marker expression which were grouped into epithelial (tumor), uroplakin-enriched, endothelial, T-cells, neutrophils, and macrophage clusters. Top differentially expressed genes between muAd-Ifnα and Ad-Ctrl were identified. Within the specific cell clusters, IPA analysis revealed significant differences between muAd-Ifnα and control. IFNα signaling and hypercytokinemia/chemokinemia were upregulated in all clusters. Cell death pathways were upregulated in tumor and endothelial clusters. T-cells demonstrated upregulation of the immunogenic cell death signaling pathway and a decrease in the Th2 pathway genes. Macrophages showed upregulation of PD1/PD-L1 pathways along with downregulation of macrophage activation pathways (alternate and classical). Multiplex immunofluorescence confirmed increased infiltration with macrophages in muAd-Ifnα treated tumors compared to controls. PD1/PD-L1 expression was reduced at 72h. Discussion This single-cell analysis builds upon our understanding of the impact of Ad-IFNα on tumor cells and other compartments of the microenvironment. These data will help identify mechanisms to improve patient selection and therapeutic efficacy of Nadofaragene firadenovec.

ABSTRACT Introduction Small cell neuroendocrine carcinoma of the urinary tract (SCNEC‐URO) has an inferior prognosis compared to conventional urothelial carcinoma (UC). Here, we evaluate the predictors and patterns of relapse after surgery. Materials and Methods We identified a definitive‐surgery cohort ( n = 224) from an institutional database of patients with cT1‐T4NxM0 SCNEC‐URO treated in 1985–2021. Histopathologic review was conducted by independent pathologists. Relapse event was the time‐to‐event outcome, and relapse probabilities were estimated using a competing risk method with cumulative incidence functions (CIFs). Fine‐Gray distribution models assessed covariate associations. Results Most patients (161, 71.9%) received neoadjuvant chemotherapy (neoCTX). Ninety two (41%) patients had relapse with 77 (83.7%) having distant organs as first metastatic sites, including 10 (10.9%) with exclusive central nervous system (CNS) metastases, mostly (9/10) within 1 year of surgery. Patients with pathologic complete response (pCR) after neoCTx had the lowest 5‐year CIF (16.5% [95% CI 9.3%–25.6%]). Patients with remaining exclusively small cell (SC) histology had the highest CIF (85.7% [95% CI 46.6–96.9]). Patients with eradicated SCNEC but remaining UC components had an intermediate‐risk CIF (32.5% [95% CI 18.6–47.2]). Multivariable analysis adjusting for neoCTx, clinical stage at diagnosis (T3/4, N0/N+ vs. T1/T2, N0), and pathologic stage (pN+ vs. pN0) demonstrated that any SCNEC histology at resection (vs. pCR) was associated with relapse risk (hazard ratio = 3.69 [95% CI 1.91–7.13], p = 0.0001). Conclusions SCNEC‐URO is a systemic disease with high risk of distant relapse including CNS. Our findings highlight unmet needs for neoadjuvant/adjuvant approaches targeting the rare SCNEC subtype and suggest adding CNS surveillance within the first year after definitive surgery to high‐risk patients. Précis (Condensed Abstract) Alongside neoadjuvant chemotherapy and cancer stage, histology at resection strongly impacts relapse risk in small cell neuroendocrine carcinomas of the urinary tract. The incidence of brain metastasis is notably higher than in “traditional” urothelial cancer within the first year after surgery, especially if small cell cancer persists, thus necessitating close neurological monitoring during this period.

Amebic liver abscess (ALA), caused by Entamoeba histolytica, is prevalent in endemic regions such as Central/South America, Southeast Asia/India, and Africa but is considered rare in North America. Symptoms of E. histolytica infection typically emerge eight to 20 weeks after exposure in endemic areas. We present the case of a 58-year-old woman who developed right-sided abdominal pain, weakness, fever, and significant weight loss. Radiological imaging revealed a large, non-cystic hepatic mass, raising suspicion of malignancy. Notably, the patient had not traveled to an endemic region in the past year. An ultrasound-guided liver biopsy drained 500 mL of purulent, grayish fluid. Cultures for bacteria and cytology for malignancy were negative. Further serological testing confirmed the diagnosis of ALA with positive E. histolytica IgG antibodies. The patient was treated with oral metronidazole, resulting in rapid symptomatic improvement. This case underscores the diagnostic challenges associated with ALA in non-endemic regions, particularly when initial presentation, imaging findings, and absence of recent travel history suggest hepatic malignancy. It highlights the importance of considering ALA in the differential diagnosis of hepatic masses, even in patients without clear exposure to endemic regions.

Alternative cleavage and polyadenylation (APA) is a gene regulatory mechanism used by cells under stress to upregulate proteostasis-promoting transcripts, but how cells achieve this remains poorly understood. Previously, we elucidated a DNA methylation-regulated APA mechanism, in which gene body DNA methylation enhances distal poly(A) isoform expression by blocking CTCF binding and chromatin loop formation at APA control regions. We hypothesized that DNA methylation-regulated APA is one mechanism cells employ to induce proteostasis-promoting poly(A) isoforms. At the DNAJB6 co-chaperone gene locus, acute heat shock resulted in binding of stress response transcription factors HSF1, ATF6, and YY1 at the APA control region and an increase in the expression of the proximal poly(A) isoform known to prevent protein aggregation. Furthermore, TET1 was recruited to rapidly demethylate DNA, facilitating CTCF binding and chromatin loop formation, thereby reinforcing preferential proximal poly(A) isoform expression. As cells recovered, the transcription factors vacated the APA control region, and DNMT1 was recruited to remethylate the region. This process resolved chromatin looping and reset the poly(A) isoform expression pattern. Our findings unveil an epigenetic mechanism enabling cells to dynamically modulate poly(A) isoforms in response to stress while shedding light on the interplay between DNA methylation, transcription factors, and chromatin looping.