Abstract Recent advances in imaging technology have highlighted that scaffold proteins and receptors are arranged in sub-synaptic nanodomains. The synaptic MAGUK scaffold protein MPP2 is a component of AMPA receptor-associated protein complexes and also binds to the synaptic cell adhesion molecule SynCAM1. Using super-resolution imaging, we now show that MPP2 and SynCAM1 are situated at the periphery of the postsynaptic density. In order to explore MPP2-associated protein complexes, we used a quantitative comparative mass spectrometry approach and identified multiple GABA A receptor subunits among the novel synaptic MPP2 interactors. We further show that GABA A receptors are found together with MPP2 in a subset of dendritic spines and thus highlight MPP2 as a scaffold molecule capable of acting as an adaptor molecule that links peripheral synaptic elements critical for inhibitory regulation to central structures at the PSD of glutamatergic synapses.

Abstract Phospholipid-phosphatase related protein 3 (PLPPR3, previously known as Plasticity Related Gene 2 or PRG2) belongs to a family of transmembrane proteins, highly expressed in neuronal development, which regulate critical growth processes in neurons. Prior work established crucial functions of PLPPR3 in axon guidance, filopodia formation and axon branching. However, little is known regarding the signaling events regulating PLPPR3 function. We identify here 26 high-confidence phosphorylation sites in the intracellular domain of PLPPR3 using mass spectrometry. Biochemical characterization established one of these – S351 – as a bona fide phosphorylation site of PKA. Experiments in neuronal cell lines suggest that phosphorylation of S351 does not regulate filopodia formation. Instead, it regulates binding to BASP1, a signaling molecule previously implicated in axonal growth and regeneration. Interestingly, both PLPPR3 intracellular domain and BASP1 enrich in presynapses in primary neurons. We propose that the presynaptic PLPPR3-BASP1 complex may function as novel signaling integrator at neuronal synapses.

At presynaptic active zones (AZs), scaffold proteins play a crucial role in coordinating synaptic vesicle (SV) release and forming intricate nanoarchitectures essential for synaptic function. Despite their suspected importance, factors governing the assembly of nanoscale AZ scaffolds have remained elusive. Here, we identify "Blobby" as a novel regulator of AZ nanopatterning, localized within the AZ scaffold. Genetic loss of the extended Blobby protein led to aberrant accumulation of AZ scaffold proteins ("blobs") and disrupted the nanoscale architecture of the AZ scaffold, resulting in a significant reduction in the packing density of voltage-gated Ca2+ channels at AZs, as observed through intravital single-molecule imaging. This disruption correlated with decreased evoked synaptic currents and SV release probability. Our findings suggest that Blobby plays a crucial role in switching the AZ scaffold into a state which allows to fine-tune the dynamic nanopatterning of Ca2+ channels to maintain proper release.

ABSTRACT Several variants of multicolor single-molecule localization microscopy (SMLM) have been developed to resolve the spatial relationship of nanoscale structures in biological samples. The oligonucleotide-based SMLM approach ‘DNA-PAINT’ robustly achieves nanometer localization precision and can be used to count binding sites within nanostructures. However, multicolor DNA-PAINT has primarily been realized by ‘Exchange-PAINT’ that requires sequential exchange of the imaging solution and thus leads to extended acquisition times. To alleviate the need for fluid exchange and to speed up the acquisition of current multichannel DNA-PAINT, we here present a novel approach that combines DNA-PAINT with simultaneous multicolor acquisition using spectral demixing (SD). By using newly designed probes and a novel multichannel registration procedure we achieve simultaneous multicolor SD-DNA-PAINT with minimal crosstalk. We demonstrate high localization precision (3 – 6 nm) and multicolor registration of dual and triple-color SD-DNA-PAINT by resolving patterns on DNA origami nanostructures and cellular structures.