After fertilization, maternal proteins in oocytes are degraded and new proteins encoded by the zygotic genome are synthesized. We found that autophagy, a process for the degradation of cytoplasmic constituents in the lysosome, plays a critical role during this period. Autophagy was triggered by fertilization and up-regulated in early mouse embryos. Autophagy-defective oocytes derived from oocyte-specific Atg5 (autophagy-related 5) knockout mice failed to develop beyond the four- and eight-cell stages if they were fertilized by Atg5-null sperm, but could develop if they were fertilized by wild-type sperm. Protein synthesis rates were reduced in the autophagy-null embryos. Thus, autophagic degradation within early embryos is essential for preimplantation development in mammals.

Macroautophagy is an intracellular degradation system that utilizes the autophagosome to deliver cytoplasmic components to the lysosome. Measuring autophagic activity is critically important but remains complicated and challenging. Here, we have developed GFP-LC3-RFP-LC3ΔG, a fluorescent probe to evaluate autophagic flux. This probe is cleaved by endogenous ATG4 proteases into equimolar amounts of GFP-LC3 and RFP-LC3ΔG. GFP-LC3 is degraded by autophagy, while RFP-LC3ΔG remains in the cytosol, serving as an internal control. Thus, autophagic flux can be estimated by calculating the GFP/RFP signal ratio. Using this probe, we re-evaluated previously reported autophagy-modulating compounds, performed a high-throughput screen of an approved drug library, and identified autophagy modulators. Furthermore, we succeeded in measuring both induced and basal autophagic flux in embryos and tissues of zebrafish and mice. The GFP-LC3-RFP-LC3ΔG probe is a simple and quantitative method to evaluate autophagic flux in cultured cells and whole organisms.

Abstract Ultrasound neuromodulation has become an innovative technology that enables non-invasive intervention in mammalian brain circuits with high spatiotemporal precision. Despite the expanding utility of ultrasound neuromodulation in the neuroscience research field and clinical applications, the molecular and cellular mechanisms by which ultrasound impacts neural activity in the brain are still largely unknown. Here, we report that transient receptor potential canonical 6 (TRPC6), a mechanosensitive non-selective cation channel, is essential for ultrasound neuromodulation of mammalian neurons in vitro and in vivo . We first demonstrated that ultrasound irradiation elicited rapid and robust Ca 2+ transients mediated via extracellular Ca 2+ influx in cultured mouse cortical and hippocampal neurons. Ultrasound-induced neuronal responses were massively diminished by blocking either the generation of action potential or synaptic transmission. Importantly, both pharmacological inhibition and genetic deficiency of TRPC6 almost completely abolished neuronal responses to ultrasound. Furthermore, we found that intracerebroventricular administration of a TRPC6 blocker significantly attenuated the population of neuronal firings in the cerebral cortex evoked by transcranial ultrasound irradiation in mice. Our findings indicate that TRPC6 is an indispensable molecule of ultrasound neuromodulation in the intact mammalian brains, providing fundamental understanding of biophysical molecular mechanisms of ultrasound neuromodulation as well as insight into its future feasibility in neuroscience and translational researches in humans.

Ultrasound neuromodulation has become an innovative technology that enables noninvasive intervention in mammalian brain circuits with high spatiotemporal precision. Despite the expanding utility of ultrasound neuromodulation in the neuroscience research field and clinical applications, the molecular and cellular mechanisms by which ultrasound impacts neural activity in the brain are still largely unknown. Here, we report that transient receptor potential canonical 6 (TRPC6), a mechanosensitive nonselective cation channel, is essential for ultrasound neuromodulation of mammalian neurons in vitro and in vivo. We first demonstrated that ultrasound irradiation elicited rapid and robust Ca 2+ transients mediated via extracellular Ca 2+ influx in cultured mouse cortical and hippocampal neurons. Ultrasound-induced neuronal responses were massively diminished by blocking either the generation of action potential or synaptic transmission. Importantly, both pharmacological inhibition and genetic deficiency of TRPC6 almost completely abolished neuronal responses to ultrasound. Furthermore, we found that intracerebroventricular administration of a TRPC6 blocker significantly attenuated the number of neuronal firings in the cerebral cortex evoked by transcranial ultrasound irradiation in mice. Our findings indicate that TRPC6 is an indispensable molecule of ultrasound neuromodulation in intact mammalian brains, providing fundamental understanding of biophysical molecular mechanisms of ultrasound neuromodulation as well as insight into its future feasibility in neuroscience and translational research in humans.