ABSTRACT The human primosome, a four-subunit complex of primase and DNA polymerase alpha (Polα), initiates DNA synthesis on both chromosome strands by generating chimeric RNA-DNA primers for loading DNA polymerases delta and epsilon (Polε). Replication protein A (RPA) tightly binds to single-stranded DNA strands, protecting them from nucleolytic digestion and unauthorized transactions. We report here that RPA plays a critical role for the human primosome during DNA synthesis across inverted repeats prone to hairpin formation. On other alternatively structured DNA forming a G-quadruplex, RPA provides no assistance for primosome. A stimulatory effect of RPA on DNA synthesis across hairpins was also observed for the catalytic domain of Polα but not of Polε. The important factors for an efficient hairpin bypass by primosome are the high affinity of RPA to DNA based on four DNA-binding domains and the interaction of the winged-helix-turn-helix domain of RPA with Polα. Binding studies indicate that this interaction stabilizes the RPA/Polα complex on the primed template. This work provides insight into a cooperative action of RPA and primosome on DNA, which is critical for DNA synthesis across inverted repeats.

The human primosome, a four-subunit complex of DNA primase and DNA polymerase alpha (Polα), plays a critical role in DNA replication by initiating RNA and DNA synthesis on both chromosome strands. A recent study has shown that a major virulence factor in the SARS-CoV-2 infection, Nsp1 (non-structural protein 1), forms a stable complex with Polα but does not affect the primosome activity. Here we show that Nsp1 inhibits DNA synthesis across inverted repeats prone to hairpin formation. Analysis of current structural data revealed the overlapping binding sites for Nsp1 and the winged helix-turn-helix domain of RPA (wHTH) on Polα, indicating a competition between them. Comparison of the inhibitory effect of Nsp1 and wHTH on DNA hairpin bypass by Polα showed an 8-fold lower IC

ABSTRACT The human primosome, a four-subunit complex of primase and DNA polymerase alpha (Polα), synthesizes chimeric RNA-DNA primers for DNA polymerases delta and epsilon to initiate DNA replication on both chromosome strands. Despite recent structural insights into the action of its two catalytic centers, the mechanism of DNA synthesis termination is still unclear. Here we report results of functional and structural studies revealing how the human primosome counts RNA-DNA primer length and timely terminates DNA elongation. Using a single-turnover primer extension assay, we defined two factors that determine a mature primer length (~35-mer): 1) a tight interaction of the C-terminal domain of the DNA primase large subunit (p58 C ) with the primer 5’-end, and 2) flexible tethering of p58 C and the DNA polymerase alpha catalytic core domain (p180 core ) to the primosome platform domain by extended linkers. The obtained data allows us to conclude that p58 C is a key regulator of all steps of RNA-DNA primer synthesis. The above-described findings provide a notable insight into the mechanism of DNA synthesis termination by a eukaryotic primosome, an important process for ensuring successful primer handover to replication DNA polymerases and for maintaining genome integrity.

ABSTRACT DNA polymerase ε (Polε) is a key enzyme for DNA replication in eukaryotes. It is attached to a helicase and performs DNA synthesis on the leading strand. Recently it was shown that the catalytic domain of yeast Polε (Polε CD ) contains a [4Fe-4S] cluster located at the base of the processivity domain (P-domain) and coordinated by four conserved cysteines. In this work, we have shown that human Polε CD (hPolε CD ) expressed in bacterial cells also contains an iron-sulfur cluster. In comparison, recombinant hPolε CD produced in insect cells contains an eight-fold-lower level of iron. Interestingly, the iron content correlates with the level of DNA-binding molecules, which suggests an important role of the iron-sulfur cluster in hPolε interaction with DNA. Indeed, mutation of two conserved cysteines that coordinate the cluster abolished template:primer binding and, therefore, DNA polymerase and proofreading exonuclease activities. We propose that the cluster regulates the conformation of the P-domain, which, like a gatekeeper, controls access to a DNA-binding cleft for a template:primer. In addition, we performed kinetic and binding studies of hPolε CD . The binding studies demonstrated low affinity of hPolε CD to DNA and a strong effect of salt concentration on stability of the hPolε CD /DNA complex. Pre-steady-state kinetic studies have shown a maximal polymerization rate constant of 51.5 s -1 and a relatively low affinity to incoming dNTP with an apparent K D of 105 μM. This work provides notable insight into the role of a [4Fe-4S] cluster in Polε function.