Whole-genome sequencing of the protozoan pathogen Trypanosoma cruzi revealed that the diploid genome contains a predicted 22,570 proteins encoded by genes, of which 12,570 represent allelic pairs. Over 50% of the genome consists of repeated sequences, such as retrotransposons and genes for large families of surface molecules, which include trans-sialidases, mucins, gp63s, and a large novel family (>1300 copies) of mucin-associated surface protein (MASP) genes. Analyses of the T. cruzi, T. brucei , and Leishmania major (Tritryp) genomes imply differences from other eukaryotes in DNA repair and initiation of replication and reflect their unusual mitochondrial DNA. Although the Tritryp lack several classes of signaling molecules, their kinomes contain a large and diverse set of protein kinases and phosphatases; their size and diversity imply previously unknown interactions and regulatory processes, which may be targets for intervention.

Leishmania species cause a spectrum of human diseases in tropical and subtropical regions of the world. We have sequenced the 36 chromosomes of the 32.8-megabase haploid genome of Leishmania major (Friedlin strain) and predict 911 RNA genes, 39 pseudogenes, and 8272 protein-coding genes, of which 36% can be ascribed a putative function. These include genes involved in host-pathogen interactions, such as proteolytic enzymes, and extensive machinery for synthesis of complex surface glycoconjugates. The organization of protein-coding genes into long, strand-specific, polycistronic clusters and lack of general transcription factors in the L. major, Trypanosoma brucei , and Trypanosoma cruzi (Tritryp) genomes suggest that the mechanisms regulating RNA polymerase II–directed transcription are distinct from those operating in other eukaryotes, although the trypanosomatids appear capable of chromatin remodeling. Abundant RNA-binding proteins are encoded in the Tritryp genomes, consistent with active posttranscriptional regulation of gene expression.

African trypanosomes are major pathogens of humans and livestock and represent a model for studies of unusual protozoal biology. We describe a high-throughput phenotyping approach termed RNA interference (RNAi) target sequencing, or RIT-seq that, using Illumina sequencing, maps fitness-costs associated with RNAi. We scored the abundance of >90,000 integrated RNAi targets recovered from trypanosome libraries before and after induction of RNAi. Data are presented for 7435 protein coding sequences, >99% of a non-redundant set in the Trypanosoma brucei genome. Analysis of bloodstream and insect life-cycle stages and differentiated libraries revealed genome-scale knockdown profiles of growth and development, linking thousands of previously uncharacterized and “hypothetical” genes to essential functions. Genes underlying prominent features of trypanosome biology are highlighted, including the constitutive emphasis on post-transcriptional gene expression control, the importance of flagellar motility and glycolysis in the bloodstream, and of carboxylic acid metabolism and phosphorylation during differentiation from the bloodstream to the insect stage. The current data set also provides much needed genetic validation to identify new drug targets. RIT-seq represents a versatile new tool for genome-scale functional analyses and for the exploitation of genome sequence data.

Nifurtimox and benznidazole are the front-line drugs used to treat Chagas disease, the most important parasitic infection in the Americas. These agents function as prodrugs and must be activated within the parasite to have trypanocidal effects. Despite >40 years of research, the mechanism(s) of action and resistance have remained elusive. Here, we report that in trypanosomes, both drugs are activated by a NADH-dependent, mitochondrially localized, bacterial-like, type I nitroreductase (NTR), and that down-regulation of this explains how resistance may emerge. Loss of a single copy of this gene in Trypanosoma cruzi , either through in vitro drug selection or by targeted gene deletion, is sufficient to cause significant cross-resistance to a wide range of nitroheterocyclic drugs. In Trypanosoma brucei , loss of a single NTR allele confers similar cross-resistance without affecting growth rate or the ability to establish an infection. This potential for drug resistance by a simple mechanism has important implications, because nifurtimox is currently undergoing phase III clinical trials against African trypanosomiasis.

Abstract Trypanosomatids, which include major pathogens of humans and livestock, are divergent eukaryotes for which cell cycle controls and the underlying mechanisms are not completely understood. Here, we describe a genome-wide RNA-interference library screen for cell cycle regulators in bloodstream form Trypanosoma brucei . We induced massive parallel knockdown and sorted the perturbed population into cell cycle stages using flow cytometry. RNAi-targets were deep-sequenced from each stage and cell cycle profiles were digitally reconstructed at a genomic scale. We identify hundreds of proteins that impact cell cycle progression; glycolytic enzymes required for G 1 S progression, DNA replication factors, mitosis regulators, proteasome and kinetochore complex components required for G 2 M progression, flagellar and cytoskeletal components required for cytokinesis, mRNA-binding factors, protein kinases and many previously uncharacterised proteins. The outputs facilitate functional annotation and drug-target prioritisation and provide comprehensive functional genomic evidence for the machineries, pathways and regulators that coordinate progression through the trypanosome cell cycle. The data can be searched and browsed using an interactive, open access, online data visualization tool ( https://tryp-cycle.onrender.com ).

Abstract Benzoxaboroles (BoBs) feature a boron-heterocyclic core and are an important innovation in the development of drugs against a range of pathogens and other pathologies. A broad spectrum of pharmacology is associated with chemically diverse BoB derivatives and includes multiple modes-of-action (MoA) and targets. However, a consensus MoA for BoBs targeting evolutionarily diverse protozoan pathogens has emerged with the identification of CPSF3/CPSF73 in the CPSF complex in both apicomplexan and kinetoplastida parasites. Here we establish a functional connection between protein sumoylation and the boron-heterocyclic scaffold shared by all BoBs using comprehensive genetic screens in Trypanosoma brucei. There is a rapid temporal and spatial shift in global protein sumoylation following BoB exposure and members of the CPSF complex are specifically destabilised in a SUMO and proteosome-dependent manner. Finally, we find rapid decrease in bulk mRNA levels, consistent with the role of CPSF3 in mRNA maturation. We propose that a combination of direct inhibition coupled with targeted degradation of CPSF3 underpins the specificity of BoBs against trypanosomatids.

Highly selective gene expression is a key requirement for antigenic variation in several pathogens, allowing evasion of host immune responses and maintenance of persistent infections. African trypanosomes, parasites that cause lethal diseases in humans and livestock, employ an antigenic variation mechanism that involves monogenic antigen expression from a pool of >2500 antigen coding genes. In other eukaryotes, the expression of individual genes can be enhanced by mechanisms involving the juxtaposition of otherwise distal chromosomal loci in the three-dimensional nuclear space. However, trypanosomes lack classical enhancer sequences or regulated transcription initiation and the monogenic expression mechanism has remained enigmatic. Here, we show that the single expressed antigen coding gene displays a specific inter-chromosomal interaction with a major mRNA splicing locus. Chromosome conformation capture (Hi-C), revealed a dynamic reconfiguration of this inter-chromosomal interaction upon activation of another antigen. Super-resolution microscopy showed the interaction to be heritable and splicing dependent. We find that the two genomic loci are connected by the antigen exclusion complex, whereby VEX1 associated with the splicing locus and VEX2 with the antigen coding locus. Following VEX2 depletion, loss of monogenic antigen expression was accompanied by increased interactions between previously silent antigen genes and the splicing locus. Our results reveal a novel mechanism to ensure monogenic expression, requiring the spatial integration of antigen transcription and mRNA splicing in a dedicated compartment. These findings suggest a new means of post-transcriptional gene regulation.

Abstract Trypanosoma brucei is a causative agent of the Human and Animal African Trypanosomiases. The mammalian stage parasites infect various tissues and organs including the bloodstream, central nervous system, skin, adipose tissue and lungs. They rely on ATP produced in glycolysis, consuming large amounts of glucose, which is readily available in the mammalian host. In addition to glucose, glycerol can also be used as a source of carbon and ATP and as a substrate for gluconeogenesis. However, the physiological relevance of glycerol-fed gluconeogenesis for the mammalian-infective life cycle forms remains elusive. To demonstrate its (in)dispensability, first we must identify the enzyme(s) of the pathway. Loss of the canonical gluconeogenic enzyme, fructose-1,6-bisphosphatase, does not abolish the process hence at least one other enzyme must participate in gluconeogenesis in trypanosomes. Using a combination of CRISPR/Cas9 gene editing and RNA interference, we generated mutants for four enzymes potentially capable of contributing to gluconeogenesis: fructose-1,6-bisphoshatase, sedoheptulose-1,7-bisphosphatase, phosphofructokinase and transaldolase, alone or in various combinations. Metabolomic analyses revealed that flux through gluconeogenesis was maintained irrespective of which of these genes were lost. Our data render unlikely a previously hypothesised role of a reverse phosphofructokinase reaction in gluconeogenesis and preclude the participation of a novel biochemical pathway involving transaldolase in the process. The sustained metabolic flux in gluconeogenesis in our mutants, including a triple-null strain, indicates the presence of a unique enzyme participating in gluconeogenesis. Additionally, the data provide new insights into gluconeogenesis and the pentose phosphate pathway, and improve the current understanding of carbon metabolism of the mammalian-infective stages of T. brucei . Author Summary Trypanosoma brucei is a unicellular parasite causing sleeping sickness in humans and nagana disease in cattle. The parasite invades the bloodstream and cerebrospinal fluid and only recently, it has been shown to infect additional tissues such as skin, adipose tissue, or lungs. While the glucose-based metabolism of the bloodstream form is well understood, the parasite’s metabolism in these secondary tissues has not been sufficiently explored, despite its importance for drug development. One possibility is the use of gluconeogenesis since the mammalian-infective stages can use glycerol as a carbon and ATP source. First, enzymes involved in gluconeogenesis have to be identified, then it can be tested if the pathway is advantageous for the survival of the parasite. We generated mutants in four different enzymes potentially involved in this metabolic pathway. Surprisingly, the flux in gluconeogenesis was maintained in all cell lines tested, implying that another non-canonical enzyme participates in the production of glucose from glycerol in these parasites.