Abstract One of the primary regulatory processes in cells is transcription, during which RNA polymerase II (Pol-II) transcribes DNA into RNA. The binding of Pol-II to its site is regulated through interactions with transcription factors (TFs) that bind to DNA at enhancer cis-regulatory elements. Measuring the enhancer activity of large libraries of distinct DNA sequences is now possible using Massively Parallel Reporter Assays (MPRAs), and computational methods have been developed to identify the dominant statistical patterns of TF binding within these large datasets. Such methods are global in their approach and may overlook important regulatory sites which function only within the local context. Here we introduce a method for inferring functional regulatory sites (their number, location and width) within an enhancer sequence based on measurements of its transcriptional activity from an MPRA method such as STARR-seq. The model is based on a mean-field thermodynamic description of Pol-II binding that includes interactions with bound TFs. Our method applied to simulated STARR-seq data for a variety of enhancer architectures shows how data quality impacts the inference and also how it can find local regulatory sites that may be missed in a global approach. We also apply the method to recently measured STARR-seq data on androgen receptor (AR) bound sequences, a TF that plays an important role in the regulation of prostate cancer. The method identifies key regulatory sites within these sequences which are found to overlap with binding sites of known co-regulators of AR. 1 Author Summary We present an inference method for identifying regulatory sites within a putative DNA enhancer sequence, given only the measured transcriptional output of a set of overlapping sequences using an assay like STARR-seq. It is based on a mean-field thermodynamic model that calculates the binding probability of Pol-II to its promoter and includes interactions with sites in the DNA sequence of interest. By maximizing the likelihood of the data given the model, we can infer the number of regulatory sites, their locations, and their widths. Since it is a local model, it can in principle find regulatory sites that are important within a local context that may get missed in a global fit. We test our method on simulated data of simple enhancer architectures and show that it is able to find only the functional sites. We also apply our method to experimental STARR-seq data from 36 androgen receptor bound DNA sequences from a prostate cancer cell line. The inferred regulatory sites overlap known important regulatory motifs and their ChIP-seq data in these regions. Our method shows potential at identifying locally important functional regulatory sites within an enhancer given only its measured transcriptional output.

ABSTRACT HOXB13 is a posterior homeobox protein that is associated with the initiation and growth of prostate cancer (PCa). While most research has focused on the role of HOXB13 on androgen receptor (AR) activity, we demonstrate that HOXB13 is essential to the proliferation of both AR-positive and -negative PCa. Strikingly, HOXB13 is remarkably selective and has almost no effect on non-prostatic tissues. Despite this common essentiality in PCa, HOXB13 activity is markedly different in AR-negative PCa, where interactions with the AP-1 change the HOXB13 cistrome in stem-cell like castration-resistant prostate cancer. We show that HOXB13 activity is commonly mediated by SMARCD2, a member of the mSWI/SNF chromatin remodeling complex. Despite the distinct transcription factor interactions in AR-positive and -negative PCa the HOXB13/SMARCD2 commonly alters chromatin accessibility at HOXB13 binding sites that causes increased proliferation in PCa. Overall, this work demonstrates a novel mechanism of action for HOXB13 and highlights its critical role in AR-negative castration-resistant prostate cancer.

Abstract NLR proteins are intracellular receptors constituting a conserved component of the innate immune system of multicellular organisms. In fungi, NLRs are characterized by high diversity of architectures and presence of amyloid signaling. Here, we explore the diverse world of effector and signaling domains of fungal NLRs using state-of-the-art bioinformatic methods including MMseqs2 for fast clustering, probabilistic context-free grammars for sequence analysis, and AlphaFold2 deep neural networks for structure prediction. In addition to substantially improving the overall annotation, especially in basidiomycetes, the study identifies novel domains and reveals the structural similarity of MLKL-related HeLo- and Goodbye-like domains forming the most abundant superfamily of fungal NLR effectors. Moreover, compared to previous studies, we found several times more amyloid motifs, including novel families, and validated aggregating and prion-forming properties of the most abundant of them in vitro and in vivo . Also, through an extensive in silico search, the NLR-associated amyloid signaling is for the first time identified in basidiomycetes. The emerging picture highlights similarities and differences in the NLR architectures and amyloid signaling in ascomycetes, basidiomycetes and other branches of life.

Abstract Background: CD276 (B7-H3) has recently emerged as a promising presumptive immune checkpoint inhibitor (ICI) and antibody-drug conjugate (ADC) target for PCa. Unfortunately, current immunotherapy trials have yielded few objective responses in PCa and hormonal therapy seldom cures necessitating the need to develop new immunotherapy or targeted antibody-drug conjugate (ADC) treatment options for PCa, including B7-H3 targeted approaches. Method: In this work, we evaluated important ADC targets and immune checkpoints (PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG3, TIGIT, OX40, 4-1BB, CTLA4, STEAP1, STEAP2, PSMA, NECTIN1, TROP-2, DLL3 and B7-H3) in various PCa cell lines and multiple patients spanning various subtypes of PCa using publicly available bulk RNA sequencing data and single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) data respectively. The results were validated at RNA and protein levels in listed cell lines. Further, the impact of androgen receptor (AR) signaling on B7-H3 expression was quantified using charcoal stripped media, AR agonist (R1881) and antagonist (enzalutamide) using real-time PCR and flow cytometry at RNA and protein levels respectively. Results: We found that B7-H3 shows high expression and very low variability compared to other ADC targets and immune checkpoints in AR-positive (LnCAP), hormone-refractory (VCAP), Castrate resistant (22RVI), AR negative (PC3, DU145), and neuroendocrine (H660) cell lines, as well as in—PCa cells and tumor microenvironment (TME) myeloid cells—of multiple patients spanning various subtypes of PCa. Western blotting confirms the ubiquitous presence of B7-H3 in all these cell lines, even when PSMA is absent. Furthermore, B7-H3 expression was modifiable via androgen depletion, R1881 supplementation, or addition of the AR antagonist enzalutamide. These changes were significant in AR-positive LnCAP cells compared to AR-negative DU145 cells further endorsing the crosstalk between AR and B7-H3 signaling pathways, which will be presented in greater detail. Conclusion: This work explores the therapeutic relevance of important ADC targets and immune checkpoints for Prostate Cancer (PCa), highlighting B7-H3 as a unique therapeutic ADC and ICI candidate across the continuum of PCa—androgen sensitive, castration resistant, and neuroendocrine—due to its stable expression across various subtypes and on TME myeloid cells. The relationship between AR and B7-H3 opens the possibility of future combination therapies based on this interaction. Citation Format: Nikita Mundhara, Shivang Sharma, Emirhan Tekoglu, Ezra G. Baraban, Nathan A. Lack, Eugene Shenderov. Investigating B7-H3 as a checkpoint and antibody drug conjugate target across prostate cancer variants- both androgen receptor dependent and independent [abstract]. In: Proceedings of the American Association for Cancer Research Annual Meeting 2024; Part 1 (Regular Abstracts); 2024 Apr 5-10; San Diego, CA. Philadelphia (PA): AACR; Cancer Res 2024;84(6_Suppl):Abstract nr 7525.