Abstract Microbiome studies in animal science using 16S rRNA gene sequencing have become increasingly common in recent years as sequencing costs continue to fall and bioinformatic tools become more powerful and user-friendly. The combination of molecular biology, microbiology, microbial ecology, computer science, and bioinformatics—in addition to the traditional considerations when conducting an animal science study—makes microbiome studies sometimes intimidating due to the intersection of different fields. The objective of this review is to serve as a jumping-off point for those animal scientists less familiar with 16S rRNA gene sequencing and analyses and to bring up common issues and concerns that arise when planning an animal microbiome study from design through analysis. This review includes an overview of 16S rRNA gene sequencing, its advantages, and its limitations; experimental design considerations such as study design, sample size, sample pooling, and sample locations; wet lab considerations such as field handing, microbial cell lysis, low biomass samples, library preparation, and sequencing controls; and computational considerations such as identification of contamination, accounting for uneven sequencing depth, constructing diversity metrics, assigning taxonomy, differential abundance testing, and, finally, data availability. In addition to general considerations, we highlight some special considerations by species and sample type.

Abstract Background Methanotrophy by the sponge-hosted microbiome has been mainly reported in the ecological context of deep-sea hydrocarbon seep niches where methane is either produced geothermically or via anaerobic methanogenic archaea inhabiting the sulfate-depleted sediments. However, methane oxidizing bacteria from the candidate phylum Binatota have recently been described and shown to be present in oxic shallow-water marine sponges, where sources of methane remain undescribed. Results Here, using an integrative - omics approach, we provide evidence for sponge-hosted bacterial methanogenesis occurring in fully oxygenated shallow water habitats. Specifically, we suggest methanogenesis occurs via at least two independent pathways involving methylamine and methylphosphonate transformations that, concomitantly to aerobic methane production, generate bioavailable nitrogen and phosphate, respectively. Methylphosphonate may be sourced from seawater continuously filtered by the sponge host. Methylamines may also be externally sourced or, alternatively, generated by a multi-step metabolic process where carnitine, derived from sponge cell debris, is transformed to methylamine by different sponge-hosted microbial lineages. Finally, methanotrophs specialized in pigment production, affiliated to the phylum Binatota, may provide a photoprotective function, closing a previously undescribed C 1 -metabolic loop that involves both the sponge host and specific members of the associated microbial community. Conclusion Given the global distribution of this ancient animal lineage and their remarkable water filtration activity, sponge hosted methane cycling may affect methane supersaturation in oxic coastal environments. Depending on the net balance between methanogenesis and methanotrophy, sponges may serve as marine sources or sinks of this potent greenhouse gas.

We compiled DNA and RNA isolation protocols for sediment bulk extraction and their yields from Guaymas Basin subsurface sediments, and evaluated their sensitivity for metagenomic and amplicon analyses of subsurface microbial communities. Guaymas Basin sediments present a challenge for DNA and RNA recovery due to high concentrations of hydrocarbons, steep thermal gradients and rapidly declining cell numbers downcore. Metagenomic library construction and sequencing was possible from as little as 0.2 to 0.5 ng DNA/cm3 sediment; PCR amplification of 16S rRNA genes required in most cases approx. 1-2 ng DNA/cm3 sediment. At in-situ temperatures of 50 to 60 degrees C, decreasing DNA recovery leads to increasingly uncertain "hit or miss" outcomes and to failures for metagenomic and amplicon analyses. DNA concentration profiles show that, even before these hot temperatures are reached, relatively moderate temperatures have a major effect on microbial abundance and DNA yield. Comparison with cell count profiles shows that hydrothermal influence is reducing downcore cell densities by multiple orders of magnitude faster compared to non-hydrothermal sediments; this effect is also visible at relatively moderate temperatures. To an even greater degree than DNA, RNA recovery is highly sensitive to downcore increasing temperatures and decreasing cell numbers, and worked best for microbial communities in cool, relatively shallow subsurface sediments.

An important and understudied area in microbial ecology concerns the very large number of very rare species within an environment. Study of such species based on non-specific sequencing of environmental samples is practically difficult simply due to their rarity. A previous report demonstrated that pretreating samples with the photoactive dye PMA before subsequent PCR and sequencing can increase sensitivity to rare species. Here we propose a mathematical model based on equilibrium chemical thermodynamics that explains this effect and suggests a simple quantitative experiment.

Abstract We explore archaeal distribution and environmental niche differentiation in sedimentary subseafloor habitats of Guaymas Basin and the adjacent Sonora Margin, located in the Gulf of California, México. Specifically, we survey diverse subseafloor habitats on the Guaymas Basin flanking regions that are extending from the spreading center, termed here “off-axis” sites. Sampling locations include (i) control sediments without hydrothermal or seep influence, (ii) Sonora Margin sediments underlying oxygen minimum zone water, (iii) compacted, highly reduced sediments from a pressure ridge with numerous seeps at the base of the Sonora Margin, and (iv) sediments impacted by hydrothermal circulation at the off-axis Ringvent site. Generally, archaeal 16S rRNA gene datasets are largely comprised of Bathyarchaeal lineages, members of the Hadesarchaea, MBG-D, TMEG, and ANME-1 groups. The most frequently observed 25 OTUs belong to members of these lineages, and correspond to approx. 40 to 80% of the sequence dataset in each sediment sample. Differential distribution patterns of these archaeal groups in downcore sediments uniquely characterize each major sedimentary environment. Variations in archaeal community composition reflect locally specific environmental challenges throughout the greater Guaymas Basin area. Background sediments are divided into surface and subsurface niches, reflecting increased selection of the archaeal community downcore. In sum, the environmental setting and history of a particular site, not isolated biogeochemical properties out of context, control the subseafloor archaeal communities in Guaymas Basin and Sonora Margin sediments.

The gastrointestinal (GI) microbiome of chelonians (testudines) plays an important role in their metabolism, nutrition, and overall health but the GI microbiome of three-toed box turtles ( Terrapene carolina triunguis ) has yet to be characterized. How the GI microbiome responds to rapidly rising environmental temperatures has also not been studied extensively in ectotherms, specifically chelonians. In this study, twenty (20) T.c.triunguis were split into control and experimental groups. The experimental group experienced 4.5°C increases every two weeks while the control group stayed at a constant ambient temperature (24°C) through the entirety of the experiment. Before each temperature increase, all turtles had cloacal swab samples taken. These samples underwent DNA extraction followed by 16S rRNA gene sequencing and microbial community analyses. Differences in diversity at the community level in the controls compared to the experimental groups were not statistically significant, indicating microbiome resilience to rapid temperature changes in T.c.triunguis , although some differentially abundant lineages were identified. Interestingly, an amplicon sequence variant belonging to the Erysipelothrix spp. was exclusively enriched in the highest temperature group relative to controls. Overall, our work suggests that there may be an innate robustness to rapid temperature swings in the microbiome of T.c.triunguis which are native to temperate North America. Despite this resilience, Erysipelothrix spp. was enriched at the highest temperature. Phylogenetic analysis of this amplicon variant showed that it is a close relative of Erysipelothrix rhusiopathiae, a pathogen of zoonotic importance associated with both wildlife and livestock.

Abstract The concept of successional trajectories describes how small differences in initial community composition can magnify through time and lead to significant differences in mature communities. For many animals, the types and sources of early-life exposures to microbes have been shown to have significant and long-lasting effects on the community structure and/or function of the microbiome. In modern commercial poultry production, chicks are reared as a single age cohort and do not directly encounter adult birds. This scenario is likely to initiate a trajectory of microbial community development that is significantly different than non-industrial settings where chicks are exposed to a much broader range of environmental and fecal inocula; however, the comparative effects of these two scenarios on microbiome development and function remain largely unknown. In this work, we performed serial transfers of cecal material through multiple generations of birds to first derive a stable source of inoculum. Subsequently, we compared microbiome development between chicks receiving this passaged cecal material, versus an environmental inoculum, to test the hypothesis that the first exposure of newly hatched chicks to microbes determines early GI microbiome structure and may have longer-lasting effects on bird health and development. Cecal microbiome dynamics and bird weights were tracked for a two-week period, with half of the birds in each treatment group exposed to a pathogen challenge at 7 days of age. We report that: i) a relatively stable community was derived after a single passage of transplanted cecal material, ii) this cecal inoculum significantly but ephemerally altered community structure relative to the environmental inoculum and PBS controls, and iii) either microbiome transplant administered at day-of-hatch appeared to have some protective effects against pathogen challenge relative to uninoculated controls. Differentially abundant taxa were identified across treatment types that may inform future studies aimed at identifying strains associated with beneficial phenotypes.