ABSTRACT During infection, plant pathogenic fungi secrete a set of molecules collectively known as effectors, involved in overcoming the host immune system and in disease establishment. Effector genes are concertedly expressed as waves all along plant pathogenic fungi lifecycle. However, little is known about how coordinated expression of effector genes is regulated. Since many effector genes are located in repeat-rich regions, the role of chromatin remodeling in the regulation of effector expression was recently investigated. In Leptosphaeria maculans , causing stem canker of oilseed rape, we established that the repressive histone modification H3K9me3 (trimethylation of Lysine 9 of Histone H3), deposited by the histone methyltransferase KMT1, was involved in the regulation of expression of genes highly expressed during infection, including effectors. Nevertheless, inactivation of KMT1 did not induce expression of these genes at the same level as observed during infection of oilseed rape, suggesting that a second regulator, such as a transcription factor (TF), might be involved. Pf2, a TF belonging to the Zn2Cys6 fungal specific TF family, was described in several Dothideomycete species as essential for pathogenicity and effector gene expression. We identified the orthologue of Pf2 in L. maculans , LmPf2, and investigated the role of LmPf2 together with KMT1, by inactivating and over-expressing LmPf2 in a wild type (WT) strain and a Δkmt1 mutant. Functional analyses of the corresponding transformants highlighted an essential role of LmPf2 in the establishment of pathogenesis. Transcriptomic analyses during axenic growth showed that LmPf2 is involved in the control of effector gene expression. We observed an enhanced effect of the over-expression of LmPf2 on effector gene expression in a Δkmt1 background, suggesting an antagonist role between KMT1 and LmPf2.

Abstract In plant-associated fungi, the role of the epigenome is increasingly recognized as an important regulator of genome structure and of the expression of genes involved in interaction(s) with the host plant. Two closely-related phytopathogenic species, Leptosphaeria maculans ‘brassicae’ (Lmb) and L. maculans ‘lepidii’ (Lml) exhibit a large conservation of genome synteny but contrasting genome structure. Lmb has undergone massive invasion of its genome by transposable elements amounting to one third of its genome and clustered in large TE-rich regions on chromosomal arms, while Lml genome has only a small amount of repeats (3% of the genome). Previous studies showed that the TE-rich regions of Lmb harbour a few species-specific effector genes, expressed during plant infection. The distinct genome structures shown by Lmb and Lml thus provides an excellent model for comparing the organization of pathogenicity/effector genes in relation to the chromatin landscape in two closely related phytopathogenic fungi. Here, we performed chromatin immunoprecipitation during axenic culture, targeting either histone modifications typical for heterochromatin or euchromatin, combined with transcriptomic analysis to analyse the influence of chromatin organisation on gene expression. In both species, we found that facultative heterochromatin landscapes associated with H3K27me3-domains are enriched with genes lacking functional annotation, including numerous candidate effector and species-specific genes. Notably, orthologous genes located in H3K27me3-domains in both species are enriched with genes encoding putative proteinaceous and metabolic effectors. These genes are mostly silenced in axenic growth conditions and are likely to be involved in interaction with the host. Compared to other fungal species, including Lml, Lmb is distinct in having large H3K9me3-domains associated with TE-rich regions that contain numerous species-specific effector-encoding genes. Discovery of these two distinctive heterochromatin landscapes now raises questions about their involvement in the regulation of pathogenicity, the dynamics of these domains during plant infection, and the selective advantage to the fungus to host effector genes in H3K9me3- or H3K27me3-domains.

Abstract The fungus Leptosphaeria maculans has an exceptionally long and complex relationship with its host plant, Brassica napus , during which it switches between different lifestyles, including asymptomatic, biotrophic, necrotrophic, and saprotrophic stages. The fungus is also exemplary of “two-speed” genome organisms in which gene-rich and repeat-rich regions alternate. Except for a few stages of plant infection under controlled conditions, nothing is known about the genes mobilized by the fungus throughout its life cycle, which may last several years in the field. We show here that about 9% of the genes of this fungus are highly expressed during its interactions with its host plant. These genes are distributed into eight well-defined expression clusters, corresponding to specific infection lifestyles or to tissue-specific genes. All expression clusters are enriched in effector genes, and one cluster is specific to the saprophytic lifestyle on plant residues. One cluster, including genes known to be involved in the first phase of asymptomatic fungal growth in leaves, is re-used at each asymptomatic growth stage, regardless of the type of organ infected. The expression of the genes of this cluster is repeatedly turned on and off during infection. Whatever their expression profile, the genes of these clusters are located in regions enriched in heterochromatin, either constitutive or facultative. These findings provide support for the hypothesis that fungal genes involved in niche adaptation are located in heterochromatic regions of the genome, conferring an extreme plasticity of expression. This work opens up new avenues for plant disease control, by identifying stage-specific effectors that could be used as targets for the identification of novel durable disease resistance genes, or for the in-depth analysis of chromatin remodeling during plant infection, which could be manipulated to interfere with the global expression of effector genes at crucial stages of plant infection. Author Summary Fungi are extremely important organisms in the global ecosystem. Some are damaging plant pathogens that threaten global food security. A knowledge of their biology and pathogenic cycle is vital for the design of environmentally-friendly control strategies. Unfortunately, many parts of their life cycle remain unknown, due to the complexity of their life-cycles and technical limitations. Here, we use a rapeseed pathogen, Leptosphaeria maculans , which has a particularly complex life-cycle, to show that large-scale RNA-Seq analyses of fungal gene expression can decipher all stages of the fungal cycle over two years of interaction with living or dead hosts, in laboratory and agricultural conditions. We found that the fungus uses about 9% of the genes of its genome specifically during interactions with the plant, and observed waves of extremely tight, complex regulation during the colonization of specific tissues and specific parts of the life-cycle. Our findings highlight the importance of genes encoding effectors, small secreted proteins manipulating the host. This work opens up new avenues for plant disease control through the identification of stage-specific effectors leading to the discovery of novel durable disease resistance genes, or the analysis of epigenetic regulation, which could be manipulated to interfere with effector gene expression.

Abstract With only a few exceptions, fungal effectors (small secreted proteins) have long been considered as species- or even isolate-specific. With the increasing availability of high-quality fungal genomes and annotations, trans-species or trans-genera families of effectors are being uncovered. Two avirulence effectors, AvrLm10A and AvrLm10B , of Leptosphaeria maculans , the fungus responsible for stem canker of oilseed rape, are members of such a large family of effectors. AvrLm10A and AvrLm10B are neighboring genes, organized in divergent transcriptional orientation. Sequence searches within the L. maculans genome show that AvrLm10A / AvrLm10B belong to a multigene family comprising five pairs of genes with a similar tail-to-tail organization. The two genes in a pair always had the same expression pattern and two expression profiles were distinguished, associated with the biotrophic colonization of cotyledons and / or petioles and stems. Of the two protein pairs further investigated Lmb_jn3_08094/Lmb_jn3_08095 and Lmb_jn3_09745 / Lmb_jn3_09746, one (Lmb_jn3_09745 / Lmb_jn3_09746) had the ability to physically interact, similarly to what was previously described for the AvrLm10A/AvrLm10B pair. AvrLm10A homologues are present in more than 30 Dothideomycete and Sordariomycete plant-pathogenic fungi whereas fewer AvrLm10B homologues were identified. One of the AvrLm10A homologues, SIX5, is an effector from Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici physically interacting with the avirulence effector Avr2. We found that AvrLm10A homologues were associated with at least eight distinct putative effector families, suggesting an ability of AvrLm10A/SIX5 to cooperate with diverse effectors. These results point to a general role of the AvrLm10A/SIX5 protein as a ‘cooperator protein’, able to interact with diverse families of effectors whose encoding gene is co-regulated with the neighboring AvrLm10A homologue.

Leptosphaeria maculans is one of the major fungal pathogens on oilseed rape (Brassica napus), causing stem canker disease. The closely related Brassica species Brassica nigra, Brassica juncea, and Brassica carinata display extreme resistance toward stem canker. In this study, we demonstrate the nonhost status of B. carinata toward L. maculans in France through field experiments and inoculations performed in controlled conditions. A few isolates moderately adapted to B. carinata, in controlled conditions, were recovered in the field on B. nigra leaves, allowing us to investigate the unusual B. carinata / L. maculans interactions using molecular, macroscopic, and microscopic analyses. A cross between a L. maculans isolate adapted to B. napus and an isolate moderately adapted to B. carinata allowed the generation, in the lab, of recombinant L. maculans strains better adapted to B. carinata than the natural parental isolate obtained from B. nigra, and highlighted the polygenic determinism of the adaptation of L. maculans to B. carinata and B. napus. This biological material will allow further investigation of the molecular determinants of the adaptation of L. maculans to nonhost species and elucidate the genetic resistance basis of B. carinata.