Fungi are of primary ecological, biotechnological and economic importance. Many fundamental biological processes that are shared by animals and fungi are studied in fungi due to their experimental tractability. Many fungi are pathogens or mutualists and are model systems to analyse effector genes and their mechanisms of diversification. In this study, we report the genome sequence of the phytopathogenic ascomycete Leptosphaeria maculans and characterize its repertoire of protein effectors. The L. maculans genome has an unusual bipartite structure with alternating distinct guanine and cytosine-equilibrated and adenine and thymine (AT)-rich blocks of homogenous nucleotide composition. The AT-rich blocks comprise one-third of the genome and contain effector genes and families of transposable elements, both of which are affected by repeat-induced point mutation, a fungal-specific genome defence mechanism. This genomic environment for effectors promotes rapid sequence diversification and underpins the evolutionary potential of the fungus to adapt rapidly to novel host-derived constraints. Leptosphaeria maculans is a plant pathogen that causes stem canker of oilseed rape. Rouxel et al. sequence and describe the key features of the L. maculansgenome, including partitioning into AT-rich blocks that are enriched in effector genes and transposable elements affected by repeat-induced point mutation.

ABSTRACT During infection, plant pathogenic fungi secrete a set of molecules collectively known as effectors, involved in overcoming the host immune system and in disease establishment. Effector genes are concertedly expressed as waves all along plant pathogenic fungi lifecycle. However, little is known about how coordinated expression of effector genes is regulated. Since many effector genes are located in repeat-rich regions, the role of chromatin remodeling in the regulation of effector expression was recently investigated. In Leptosphaeria maculans , causing stem canker of oilseed rape, we established that the repressive histone modification H3K9me3 (trimethylation of Lysine 9 of Histone H3), deposited by the histone methyltransferase KMT1, was involved in the regulation of expression of genes highly expressed during infection, including effectors. Nevertheless, inactivation of KMT1 did not induce expression of these genes at the same level as observed during infection of oilseed rape, suggesting that a second regulator, such as a transcription factor (TF), might be involved. Pf2, a TF belonging to the Zn2Cys6 fungal specific TF family, was described in several Dothideomycete species as essential for pathogenicity and effector gene expression. We identified the orthologue of Pf2 in L. maculans , LmPf2, and investigated the role of LmPf2 together with KMT1, by inactivating and over-expressing LmPf2 in a wild type (WT) strain and a Δkmt1 mutant. Functional analyses of the corresponding transformants highlighted an essential role of LmPf2 in the establishment of pathogenesis. Transcriptomic analyses during axenic growth showed that LmPf2 is involved in the control of effector gene expression. We observed an enhanced effect of the over-expression of LmPf2 on effector gene expression in a Δkmt1 background, suggesting an antagonist role between KMT1 and LmPf2.

Abstract The fungus Leptosphaeria maculans has an exceptionally long and complex relationship with its host plant, Brassica napus , during which it switches between different lifestyles, including asymptomatic, biotrophic, necrotrophic, and saprotrophic stages. The fungus is also exemplary of “two-speed” genome organisms in which gene-rich and repeat-rich regions alternate. Except for a few stages of plant infection under controlled conditions, nothing is known about the genes mobilized by the fungus throughout its life cycle, which may last several years in the field. We show here that about 9% of the genes of this fungus are highly expressed during its interactions with its host plant. These genes are distributed into eight well-defined expression clusters, corresponding to specific infection lifestyles or to tissue-specific genes. All expression clusters are enriched in effector genes, and one cluster is specific to the saprophytic lifestyle on plant residues. One cluster, including genes known to be involved in the first phase of asymptomatic fungal growth in leaves, is re-used at each asymptomatic growth stage, regardless of the type of organ infected. The expression of the genes of this cluster is repeatedly turned on and off during infection. Whatever their expression profile, the genes of these clusters are located in regions enriched in heterochromatin, either constitutive or facultative. These findings provide support for the hypothesis that fungal genes involved in niche adaptation are located in heterochromatic regions of the genome, conferring an extreme plasticity of expression. This work opens up new avenues for plant disease control, by identifying stage-specific effectors that could be used as targets for the identification of novel durable disease resistance genes, or for the in-depth analysis of chromatin remodeling during plant infection, which could be manipulated to interfere with the global expression of effector genes at crucial stages of plant infection. Author Summary Fungi are extremely important organisms in the global ecosystem. Some are damaging plant pathogens that threaten global food security. A knowledge of their biology and pathogenic cycle is vital for the design of environmentally-friendly control strategies. Unfortunately, many parts of their life cycle remain unknown, due to the complexity of their life-cycles and technical limitations. Here, we use a rapeseed pathogen, Leptosphaeria maculans , which has a particularly complex life-cycle, to show that large-scale RNA-Seq analyses of fungal gene expression can decipher all stages of the fungal cycle over two years of interaction with living or dead hosts, in laboratory and agricultural conditions. We found that the fungus uses about 9% of the genes of its genome specifically during interactions with the plant, and observed waves of extremely tight, complex regulation during the colonization of specific tissues and specific parts of the life-cycle. Our findings highlight the importance of genes encoding effectors, small secreted proteins manipulating the host. This work opens up new avenues for plant disease control through the identification of stage-specific effectors leading to the discovery of novel durable disease resistance genes, or the analysis of epigenetic regulation, which could be manipulated to interfere with effector gene expression.

Abstract With only a few exceptions, fungal effectors (small secreted proteins) have long been considered as species- or even isolate-specific. With the increasing availability of high-quality fungal genomes and annotations, trans-species or trans-genera families of effectors are being uncovered. Two avirulence effectors, AvrLm10A and AvrLm10B , of Leptosphaeria maculans , the fungus responsible for stem canker of oilseed rape, are members of such a large family of effectors. AvrLm10A and AvrLm10B are neighboring genes, organized in divergent transcriptional orientation. Sequence searches within the L. maculans genome show that AvrLm10A / AvrLm10B belong to a multigene family comprising five pairs of genes with a similar tail-to-tail organization. The two genes in a pair always had the same expression pattern and two expression profiles were distinguished, associated with the biotrophic colonization of cotyledons and / or petioles and stems. Of the two protein pairs further investigated Lmb_jn3_08094/Lmb_jn3_08095 and Lmb_jn3_09745 / Lmb_jn3_09746, one (Lmb_jn3_09745 / Lmb_jn3_09746) had the ability to physically interact, similarly to what was previously described for the AvrLm10A/AvrLm10B pair. AvrLm10A homologues are present in more than 30 Dothideomycete and Sordariomycete plant-pathogenic fungi whereas fewer AvrLm10B homologues were identified. One of the AvrLm10A homologues, SIX5, is an effector from Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici physically interacting with the avirulence effector Avr2. We found that AvrLm10A homologues were associated with at least eight distinct putative effector families, suggesting an ability of AvrLm10A/SIX5 to cooperate with diverse effectors. These results point to a general role of the AvrLm10A/SIX5 protein as a ‘cooperator protein’, able to interact with diverse families of effectors whose encoding gene is co-regulated with the neighboring AvrLm10A homologue.

Abstract Recognition of a pathogen avirulence (AVR) effector protein by a cognate plant resistance (R) protein triggers a set of immune responses that render the plant resistant. Pathogens can escape this so-called Effector-Triggered Immunity (ETI) by different mechanisms including the deletion or loss-of-function mutation of the AVR gene, the incorporation of point mutations that allow recognition to be evaded while maintaining virulence function, and the acquisition of new effectors that suppress AVR recognition. The Dothideomycete Leptosphaeria maculans , causal agent of oilseed rape stem canker, is one of the few fungal pathogens where suppression of ETI by an AVR effector has been demonstrated. Indeed, AvrLm4-7 suppresses Rlm3- and Rlm9- mediated resistance triggered by AvrLm3 and AvrLm5-9, respectively. The presence of AvrLm4-7 does not impede AvrLm3 and AvrLm5-9 expression, and the three AVR proteins do not appear to physically interact. To decipher the epistatic interaction between these L. maculans AVR effectors, we determined the crystal structure of AvrLm5-9 and obtained a 3D model of AvrLm3, based on the crystal structure of Ecp11-1, a homologous AVR effector candidate from Fulvia fulva . Despite a lack of sequence similarity, AvrLm5-9 and AvrLm3 are structural analogues of AvrLm4-7 (structure previously characterized). Structure-informed sequence database searches identified a larger number of putative structural analogues among L. maculans effector candidates, including the AVR effector AvrLmS-Lep2, all produced during the early stages of oilseed rape infection, as well as among effector candidates from other phytopathogenic fungi. These structural analogues are named LARS (for Leptosphaeria AviRulence and Suppressing) effectors. Remarkably, transformants of L. maculans expressing one of these structural analogues, Ecp11-1, triggered oilseed rape immunity in several genotypes carrying Rlm3 . Furthermore, this resistance could be suppressed by AvrLm4-7. These results suggest that Ecp11-1 shares a common activity with AvrLm3 within the host plant which is detected by Rlm3, or that the Ecp11-1 structure is sufficiently close to that of AvrLm3 to be recognized by Rlm3. Author summary An efficient strategy to control fungal diseases in the field is genetic control using resistant crop cultivars. Crop resistance mainly relies on gene-for-gene relationships between plant resistance ( R ) genes and pathogen avirulence ( AVR ) genes, as defined by Flor in the 1940s. However, such gene-for-gene relationships can increase in complexity over the course of plant-pathogen co-evolution. Resistance against the plant-pathogenic fungus Leptosphaeria maculans by Brassica napus and other Brassica species relies on the recognition of effector (AVR) proteins by R proteins; however, L. maculans produces an effector that suppresses a subset of these specific resistances. Using a protein structure approach, we revealed structural analogy between several of the resistance-triggering effectors, the resistance-suppressing effector, and effectors from other plant-pathogenic species in the Dothideomycetes and Sordariomycetes classes, defining a new family of effectors called LARS. Notably, cross-species expression of one LARS effector from Fulvia fulva , a pathogen of tomato, in L. maculans resulted in recognition by several resistant cultivars of oilseed rape. These results highlight the need to integrate knowledge on effector structures to improve resistance management and to develop broad-spectrum resistances for multi-pathogen control of diseases.

Leptosphaeria maculans is one of the major fungal pathogens on oilseed rape (Brassica napus), causing stem canker disease. The closely related Brassica species Brassica nigra, Brassica juncea, and Brassica carinata display extreme resistance toward stem canker. In this study, we demonstrate the nonhost status of B. carinata toward L. maculans in France through field experiments and inoculations performed in controlled conditions. A few isolates moderately adapted to B. carinata, in controlled conditions, were recovered in the field on B. nigra leaves, allowing us to investigate the unusual B. carinata / L. maculans interactions using molecular, macroscopic, and microscopic analyses. A cross between a L. maculans isolate adapted to B. napus and an isolate moderately adapted to B. carinata allowed the generation, in the lab, of recombinant L. maculans strains better adapted to B. carinata than the natural parental isolate obtained from B. nigra, and highlighted the polygenic determinism of the adaptation of L. maculans to B. carinata and B. napus. This biological material will allow further investigation of the molecular determinants of the adaptation of L. maculans to nonhost species and elucidate the genetic resistance basis of B. carinata.

Leptosphaeria maculans is a pathogen of oilseed rape (Brassica napus), mainly controlled by major resistance genes (Rlm) in varieties. Rlm genes can rapidly be overcome following the selection of virulent isolates with deletions or mutations in the corresponding avirulence genes (AvrLm). Reasoned management of Rlm genes relies on the detection and monitoring of virulent isolates in populations. Based on previous knowledge of AvrLm gene polymorphism, we developed a tool combining multiplex PCR and Illumina sequencing to characterize allelic variants for eight avirulence genes in field L. maculans populations. We tested the method on DNA pools of 71 characterized L. maculans isolates and of leaf spots from 32 L. maculans isolates. After multiplex-PCR and sequencing with MiSeq technology, reads were mapped on an in-house AvrLm sequence database. Data were filtered using thresholds defined from control samples included in each run. Proportions of each allelic variant per gene, including deletions, perfectly correlated with expected ones. The method was applied to around 1300 symptoms (42 pools of mainly 32 leaf spots) from nine fields. The proportion of virulent isolates estimated by sequencing leaf spot pools perfectly correlated with those estimated by pathotyping. In addition, the proportions of allelic variants determined at the national scale also correlated with those previously determined following individual sequencing of eight AvrLm genes in a representative collection of isolates. Finally, the method also allowed us to detect still undescribed and rare allelic variants. Altogether, the method appeared suitable for large-scale and regular monitoring of L. maculans populations.

Abstract From sowing in late summer until harvest in following summer, oilseed rape can be infected by several fungi, which foliar symptoms (leaf spots) coexist on the crop. Training an expert at their identification is quick for the typical symptoms with characteristic appearance. However, in many cases the size, colour and morphology are similar and for the atypical symptoms, there is a risk of confusion or in-decidability. Also, scouting the fields for expert training is not possible at all seasons and all diseases might not be seen in all years and all places. The aim of our study was to produce large sets of pictures annotated by several experts, from which tables illustrating the diversity of symptom appearance were chosen. These tables will enable assistance to diagnostic and expert training.

Crop residues are a crucial ecological niche with a major biological impact on agricultural ecosystems. In this study we used a combined diachronic and synchronic field experiment based on wheat-oilseed rape rotations to test the hypothesis that plant is a structuring factor of microbial communities in crop residues, and that this effect decreases over time with their likely progressive degradation and colonization by other microorganisms. We characterized an entire fungal and bacterial community associated with 150 wheat and oilseed rape residue samples at a plurennial scale by metabarcoding. The impact of plant species on the residue microbiota decreased over time and our data revealed turnover, with the replacement of oligotrophs, often plant-specific genera (such as pathogens) by copiotrophs, belonging to more generalist genera. Within a single cropping season, the plant-specific genera and species were gradually replaced by taxa that are likely to originate from the soil. These changes occurred more rapidly for bacteria than for fungi, known to degrade complex compounds. Overall, our findings suggest that crop residues constitute a key fully-fledged microbial ecosystem. Taking into account this ecosystem, that has been neglected for too long, is essential, not only to improve the quantitative management of residues, the presence of which can be detrimental to crop health, but also to identify groups of beneficial micro-organisms. Our findings are of particular importance, because the wheat-oilseed rape rotation, in which no-till practices are frequent, is particularly widespread in the European arable cropping systems.

Abstract This study is the first to compare culture-dependent (strain isolation plus molecular identification) and culture-independent (whole-community metabarcode sequencing) approaches for characterizing the microbiota of crop residues. We investigated the diversity of fungal and bacterial communities in wheat and oilseed rape residues, using two different culture-dependent strategies to cover the maximum diversity for each kingdom: broad substrate sampling coupled with low-throughput isolation and diversity analysis for fungi, and reduced substrate sampling coupled with high-throughput isolation and diversity analysis for bacteria. The proportion of cultivable microorganisms was neither as low as the ‘1%’ paradigm long associated with the rhizosphere microflora, nor as high as the 50% sometimes reported for the phyllosphere microflora. It was, thus, intermediate between the values for soil and plants. This finding is consistent with residues being considered to constitute an ecotone, at the interface between soil and phyllosphere. Isolation and metabarcoding provided consistent complementary information: they revealed close community profiles, leading to the identification of several common and specific amplicon sequence variants (ASVs). The power of the culture-independent approach was thus confirmed. By contrast the culture-dependent approach was less weak than anticipated. Firstly, it provided complementary information about microbial diversity, with several ASVs not retrieved by metabarcoding being identified after isolation in the community-based culture collection. Secondly, this approach made it possible to preserve and test different taxa either individually or after the creation of synthetic communities, for deciphering the ecological functions of communities beyond merely descriptive aspects.