Abstract Osteoarthritis is a degenerative disease of synovial joints affecting all tissues, including the articular cartilage and underlying subchondral bone. Osteoarthritis animal models can recapitulate aspects of human disease progression and are commonly used to test the development of drugs, biomaterials, and cell therapies for treatment. The rat medial meniscus transection (MMT) model is a surgically induced post-traumatic osteoarthritis model and is one of the most commonly used models for therapeutic development; however, it is typically used to evaluate the efficacy of therapies to prevent disease development rather than testing the treatment of disease progression in already established disease. We describe herein, the qualitative and quantitative changes to articular cartilage, subchondral bone, and formation of osteophytes in rats at early-(3-weeks post-surgery), mid-(6-weeks post-surgery) and late-(12-weeks post-surgery) stages of osteoarthritis progression. Tibiae of MMT-operated animals showed loss of proteoglycan and fibrillation formation on articular cartilage surfaces as early as 3-weeks post-surgery. Using a contrast-enhanced μCT technique, quantitative, 3-dimensional analysis of the tibiae showed that the articular cartilage initially thickened at 3- and 6-weeks post-surgery and then decreased at 12-weeks post-surgery. This decrease in cartilage thickness corresponded with increased lesions in the articular cartilage, including fully degraded surfaces down to the subchondral bone layer. In this rat MMT model, subchondral bone thickening was significant at 6-weeks post-surgery and seem to follow cartilage damage. Osteophytes were found at 3-weeks post-surgery, which coincided with articular cartilage degradation. Cartilaginous osteophytes preceded mineralization suggesting that these marginal tissue growths most likely occurred through endochondral ossification. The use of the rat MMT model has predominantly been used out to 3-weeks, and most studies determine the effect of therapies to delay or prevent the onset of osteoarthritis. We provide evidence that an extension of the rat MMT model out to 6 and 12 weeks resembled more severe phenotypes of human osteoarthritis. The mid- to late-stages of rat MMT model can be used to evaluate the therapeutic efficacy of novel treatments to treat the progression of established disease — since patients typically present in the clinic when the disease is established and becomes symptomatic, thus evaluating the efficacy of new treatments at the late stage will be important for eventual clinical translation.

Abstract Craniofacial bone loss is a complex clinical problem with limited regenerative solutions. Currently, BMP2 is used as a bone-regenerative therapy in adults, but in pediatric cases of bone loss, it is not FDA-approved due to concerns of life-threatening inflammation and cancer. Development of a bone-regenerative therapy for children will transform our ability to reduce the morbidity associated with current autologous bone grafting techniques. We discovered that JAGGED1 (JAG1) induces cranial neural crest (CNC) cell osteoblast commitment during craniofacial intramembranous ossification, suggesting that exogenous JAG1 delivery is a potential craniofacial bone-regenerative approach. In this study, we found that JAG1 delivery using synthetic hydrogels containing O9-1 cells, a CNC cell line, into critical-sized calvarial defects in C57BL/6 mice provided robust bone-regeneration. Since JAG1 signals through canonical ( Hes1/Hey1 ) and non-canonical (JAK2) NOTCH pathways in CNC cells, we used RNAseq to analyze transcriptional pathways activated in CNC cells treated with JAG1±DAPT, a NOTCH-canonical pathway inhibitor. JAG1 upregulated expression of multiple NOTCH canonical pathway genes ( Hes1 ), which were downregulated in the presence of DAPT. JAG1 also induced bone chemokines ( Cxcl1 ), regulators of cytoskeletal organization and cell migration ( Rhou ), signaling targets (STAT5), promoters of early osteoblast cell proliferation ( Prl2c2, Smurf1 and Esrra ), and, inhibitors of osteoclasts ( Id1 ). In the presence of DAPT, expression levels of Hes1 and Cxcl1 were decreased, whereas, Prl2c2, Smurf1, Esrra, Rhou and Id1 remain elevated, suggesting that JAG1 induces osteoblast proliferation through these non-canonical genes. Pathway analysis of JAG1+DAPT-treated CNC cells revealed significant upregulation of multiple non-canonical pathways, including the cell cycle, tubulin pathway, regulators of Runx2 initiation and phosphorylation of STAT5 pathway. In total, our data show that JAG1 upregulates multiple pathways involved in osteogenesis, independent of the NOTCH canonical pathway. Moreover, our findings suggest that JAG1 delivery using a synthetic hydrogel, is a bone-regenerative approach with powerful translational potential.

Abstract Orofacial clefts are the most common craniofacial congenital anomaly. Following cleft palate repair, up to 60% of surgeries have wound healing complications leading to oronasal fistula (ONF), a persistent connection between the roof of the mouth and the nasal cavity. The current gold standard methods for ONF repair use human allograft tissues; however, these procedures have risks of graft infection and/or rejection, requiring surgical revisions. Immunoregenerative therapies present a novel alternative approach to harness the body’s immune response and enhance the wound healing environment. We utilized a repurposed FDA-approved immunomodulatory drug, FTY720, to reduce the egress of lymphocytes and induce immune cell fate switching toward pro-regenerative phenotypes. Here, we engineered a bilayer biomaterial system using Tegaderm™, a liquid-impermeable wound dressing, to secure and control the delivery of FTY720- nanofiber scaffolds (FTY720-NF). We optimized release kinetics of the bilayer FTY720-NF to sustain drug release for up to 7d with safe, efficacious transdermal absorption and tissue biodistribution. Through comprehensive immunophenotyping, our results illustrate a pseudotime pro-regenerative state transition in recruited hybrid immune cells to the wound site. Additional histological assessments established a significant difference in full thickness ONF closure in mice on Day 7 following treatment with bilayer FTY720-NF, compared to controls. These findings demonstrate the utility of immunomodulatory strategies for oral wound healing, better positing the field to develop more efficacious treatment options for pediatric patients. One Sentence Summary Local delivery of bilayer FTY720-nanofiber scaffolds in an ONF mouse model promotes complete wound closure through modulation of pro-regenerative immune and stromal cells.

Traumatic composite bone-muscle injuries, such as open fractures, often require multiple surgical interventions and still typically result in long-term disability. Clinically, a critical indicator of composite injury severity is vascular integrity; vascular damage alone is sufficient to assign an open fracture to the most severe category. Challenging bone injuries are often treated with bone morphogenetic protein 2 (BMP-2), an osteoinductive growth factor, delivered on collagen sponge. Previous studies in a composite defect model found that a minimally bridging dose in the segmental defect model was unable to overcome concomitant muscle damage, but the effect of BMP dose on composite injuries has not yet been studied. Here, we test the hypotheses that BMP-2-mediated functional regeneration of composite extremity injuries is dose dependent and can be further enhanced via co-delivery of adipose-derived microvascular fragments (MVF), which have been previously shown to increase tissue vascular volume. Although MVF treatment did not improve healing outcomes, we observed a significant BMP-2 dose-dependent increase in regenerated bone volume and biomechanical properties. While high dose BMP-2 delivery can induce heterotopic ossification (HO) and increased inflammation, the maximum 10 ug dose used in this study did not result in HO and was associated with a lower circulating inflammatory cytokine profile than the low dose (2.5 ug) group. These data support the potential benefits of an increased, though still moderate, BMP-2 dose for treatment of bone defects with concomitant muscle damage. Future work to improve vascularization may further improve healing.

Objective: Osteoarthritis (OA) is a chronic degenerative disease of the joints characterized by articular cartilage degradation. While there are clear sex differences in OA development in humans, most pre-clinical research has been conducted solely in male animals thus limiting the ability of these findings to be generalized to both sexes in the context of this disease. The objective of this study was to determine if sex impacts the progression and severity of OA in the rat medial meniscal tear (MMT) preclinical animal model used to surgically induce OA. It was hypothesized that differences would be observed between males and females following MMT surgery. Design: A MMT model was employed in male and female Lewis rats to induce OA. Animals were euthanized 3 weeks post-surgery and EPIC-μCT was used to quantitatively evaluate articular cartilage structure and composition, osteophyte volumes and subchondral bone structure. Results: Quantitative analysis of the medial 1/3 articular cartilage via EPIC-μCT showed increased cartilage thickness and proteoglycan loss in the MMT of both sexes, when compared to sham. Additionally, both male and female animals in the MMT group had increased subchondral bone mineral density and larger total osteophyte volumes due to MMT. Conclusion: These data demonstrate that OA can be induced in both sexes using the rat MMT model. Moving forward, adding sex as a factor in preclinical OA studies should be standard practice in pre-clinical studies in order to elucidate more inclusive and translatable results into the clinic.

Mechanical loads exerted on the skeleton during activities such as walking are important regulators of bone repair, but dynamic biomechanical signals are difficult to measure inside the body. The inability to measure the mechanical environment in injured tissues is a significant barrier to developing integrative regenerative and rehabilitative strategies that can accelerate recovery from fracture, segmental bone loss, and spinal fusion. Here we engineered an implantable strain sensor platform and measured strain across a bone defect in real-time throughout rehabilitation. We used the sensor to longitudinally quantify mechanical cues imparted by a load-sharing fixation plate that significantly enhanced bone regeneration in rats. We found that sensor readings correlated with the status of healing, suggesting a potential role for strain sensing as an X-ray-free healing assessment platform. This study demonstrates a promising approach to quantitatively develop and exploit mechanical rehabilitation strategies that enhance bone repair.

Bone development, maintenance, and regeneration are remarkably sensitive to mechanical cues. Consequently, mechanical stimulation has long been sought as a putative target to promote endogenous healing after fracture. Given the transient nature of bone repair, tissue-level mechanical cues evolve rapidly over time after injury and are challenging to measure non-invasively. The objective of this work was to develop and characterize an implantable strain sensor for non-invasive monitoring of axial strain across a rodent femoral defect during functional activity. Herein, we present the design, characterization, and in vivo demonstration of the device capabilities for quantitatively interrogating physiological dynamic strains during bone regeneration. Ex vivo experimental characterization of the device showed that it exceeded the technical requirements for sensitivity, signal resolution, and electromechanical stability. The digital telemetry minimized power consumption, enabling long-term intermittent data collection. Devices were implanted in a rat 6 mm femoral segmental defect model and after three days, data were acquired wirelessly during ambulation and synchronized to corresponding radiographic videos, validating the ability of the sensor to non-invasively measure strain in real-time. Lastly, in vivo strain measurements were utilized in a finite element model to estimate the strain distribution within the defect region. Together, these data indicate the sensor is a promising technology to quantify local tissue mechanics in a specimen specific manner, facilitating more detailed investigations into the role of the mechanical environment in dynamic skeletal healing and remodeling.

Abstract Mesenchymal stromal cells (MSCs) have shown promise as a treatment for osteoarthritis (OA); however, effective translation has been limited by numerous factors ranging from high variability and heterogeneity of hMSCs, to suboptimal delivery strategies, to poor understanding of critical quality and potency attributes. The objective of the current study was to assess the effects of biomaterial encapsulation in alginate microcapsules on human MSC (hMSC) secretion of immunomodulatory cytokines in an OA microenvironment and therapeutic efficacy in treating established OA. Lewis rats underwent Medial Meniscal Transection (MMT) surgery to induce OA. Three weeks post-surgery, after OA was established, rats received intra-articular injections of either encapsulated hMSCs or controls (saline, empty capsules, or non-encapsulated hMSCs). Six weeks post-surgery, microstructural changes in the knee joint were quantified using contrast enhanced microCT. Encapsulated hMSCs attenuated progression of OA including articular cartilage degeneration (swelling and cartilage loss) and subchondral bone remodeling (thickening and hardening). A multiplexed immunoassay panel (41 cytokines) was used to profile the in vitro secretome of encapsulated and non-encapsulated hMSCs in response to IL-1□, a key cytokine involved in OA. Non-encapsulated hMSCs showed an indiscriminate increase in all cytokines in response to IL-1□ while encapsulated hMSCs showed a highly targeted secretory response with increased expression of some pro-inflammatory (IL-1β, IL-6, IL-7, IL-8), anti-inflammatory (IL-1RA), and chemotactic (G-CSF, MDC, IP10) cytokines. These data show that biomaterial encapsulation using alginate microcapsules can modulate hMSC paracrine signaling in response to OA cytokines and enhance the therapeutic efficacy of the hMSCs in treating established OA.

Skeletal muscle has a remarkable regenerative capacity; however, after volumetric muscle loss (VML) due to traumatic injury or surgery this regenerative response is significantly diminished, causing chronic functional deficits. The critical defect size at which the muscle will not functionally recover has not yet been established and subsequently, the relative contribution of crucial muscle components, including muscle stem cells and the muscle stem cell niche, are unknown. In this study, we created VML injuries of 2, 3, or 4 mm diameter, full-thickness defects in the mouse quadriceps. The 2, 3, and 4 mm injuries resulted in a defect of 5, 15, or 30% of the quadriceps mass, respectively. At 14 and 28 days after injury, histological analyses revealed injury size-dependent differences in myofiber morphology and fibrosis; the number of small myofibers increased with increasing injury size. The results showed that the 3 mm injury was at a threshold point, as myofibers were unable to bridge the defect, there was persistent fibrosis and inflammation, and significantly increased number of myofibers with centrally located nuclei. We then further investigated the 3 mm VML for nerve and vascular regeneration. These injured muscles were accompanied by a drastic increase in denervated neuromuscular junctions (NMJ), while assessment of angiogenesis via micro-CT analysis revealed a significant increase in vascular volume primarily from small diameter vessels after VML injury. Collectively, these data indicate that the spatial and temporal control of the fibrotic and neuromotor response are critical to regeneration and could be potential therapeutic targets, as they are the most dysregulated components of the muscle stem cell niche after VML.

Abstract Compromised vascular supply and insufficient neovascularization impede bone repair, increasing risk of non-union. Cyr61, Cysteine-rich angiogenic inducer of 61kD (also known as CCN1), is a matricellular growth factor that is regulated by mechanical cues during fracture repair. Here, we map the distribution of endogenous Cyr61 during bone repair and evaluate the effects of recombinant Cyr61 delivery on vascularized bone regeneration. In vitro, Cyr61 treatment did not alter chondrogenesis or osteogenic gene expression, but significantly enhanced angiogenesis. In a mouse femoral fracture model, Cyr61 delivery did not alter cartilage or bone formation, but accelerated neovascularization during fracture repair. Early initiation of ambulatory mechanical loading disrupted Cyr61-induced neovascularization. Together, these data indicate that Cyr61 delivery can enhance angiogenesis during bone repair, particularly for fractures with stable fixation, and may have therapeutic potential for fractures with limited blood vessel supply.