The endoplasmic reticulum (ER) is a site of protein biogenesis in eukaryotic cells. Perturbing ER homeostasis activates stress programs collectively called the unfolded protein response (UPR). The UPR enhances production of ER-resident chaperones and enzymes to reduce the burden of misfolded proteins. On resolution of ER stress, ill-defined, selective autophagic programs remove excess ER components. Here we identify Sec62, a constituent of the translocon complex regulating protein import in the mammalian ER, as an ER-resident autophagy receptor. Sec62 intervenes during recovery from ER stress to selectively deliver ER components to the autolysosomal system for clearance in a series of events that we name recovER-phagy. Sec62 contains a conserved LC3-interacting region in the C-terminal cytosolic domain that is required for its function in recovER-phagy, but is dispensable for its function in the protein translocation machinery. Our results identify Sec62 as a critical molecular component in maintenance and recovery of ER homeostasis. Fumagalli et al. show that Sec62 delivers ER components to the autolysosome for clearance by acting as a receptor for autophagy protein LC3-II. This identifies Sec62 as a critical factor for selective ER turnover.

Cardiovascular diseases (CVDs) are the most common cause of mortality worldwide. In acute cardiovascular conditions, time is a crucial player in the outcomes of disease management. Given the ease and noninvasiveness of obtaining saliva, salivary biomarkers may provide a rapid and efficient diagnosis of CVD. Here, we reviewed the published data on the value of salivary molecules for diagnosis of CVD, especially in acute care settings. In this review, we show that some biomarkers such as salivary creatinine kinase myocardial band, C‐reactive protein, troponin‐1, and myoglobin exhibited promising diagnostic values that were comparable to their serum counterparts. Other molecules were also investigated and showed controversial results, including myeloperoxidase, brain natriuretic peptide, and some oxidative stress markers. Based on our review, we concluded that the clinical use of salivary biomarkers to diagnose CVD is promising; however, it is still in the early stage of development. Further studies are needed to validate these findings, determine cutoff values for diagnosis, and compare them to other established biomarkers currently in clinical use.

Abstract Most sRNA biogenesis mechanisms involve either RNAseIII cleavage or ping-pong amplification by different Piwi proteins harboring slicer activity. Here, we follow the question why the mechanism of transgene-induced silencing in the ciliate Paramecium needs both Dicer activity and two Ptiwi proteins. This pathway involves primary siRNAs produced from non-translatable transgenes and secondary siRNAs from endogenous remote loci. Our data does not indicate any signatures from ping-pong amplification but Dicer cleavage of long dsRNA. We show that Ptiwi13 and 14 have different preferences for primary and secondary siRNAs but do not load them mutually exclusive. Both Piwis enrich for antisense RNAs and Ptiwi14 loaded siRNAs show a 5′-U signature. Both Ptiwis show in addition a general preference for Uridine-rich sRNAs along the entire sRNA length. Our data indicates both Ptiwis and 2’-O-methylation to contribute to strand selection of Dicer cleaved siRNAs. This unexpected function of two distinct vegetative Piwis extends the increasing knowledge of the diversity of Piwi functions in diverse silencing pathways. As both Ptiwis show differential subcellular localisation, Ptiwi13 in the cytoplasm and Ptiwi14 in the vegetative macronucleus, we conclude that cytosolic and nuclear silencing factors are necessary for efficient chromatin silencing.

SUMMARY Protein import into the endoplasmic reticulum (ER) is essential for about 30% of the human proteome. It involves targeting of precursor proteins to the ER and insertion into or translocation across the ER membrane. Furthermore, it relies on signals in the precursor polypeptides and components, which read the signals and facilitate their targeting to a protein-conducting channel in the ER membrane, the Sec61 complex. Compared to the SRP- and TRC-dependent pathways, little is known about the SRP-independent/SND pathway. Our aim was to identify additional components and characterize the client spectrum of the human SND pathway. The established strategy of combining depletion of the central hSnd2-component from HeLa cells with proteomic- and differential protein abundance-analysis was used. The SRP and TRC targeting pathways were analyzed in comparison. TMEM109 was characterized as hSnd3. Unlike SRP but similar to TRC, the SND clients are predominantly membrane proteins with N-terminal, central, or C-terminal targeting signals.

Abstract The unicellular ciliate Paramecium contains a large vegetative macronucleus with several unusual characteristics including an extremely high coding density and high polyploidy. As macronculear chromatin is devoid of heterochromatin our study characterizes the functional epigenomic organisation necessary for gene regulation and proper PolII activity. Histone marks (H3K4me3, H3K9ac, H3K27me3) revealed no narrow peaks but broad domains along gene bodies, whereas intergenic regions were devoid of nucleosomes. Our data implicates H3K4me3 levels inside ORFs to be the main factor to associate with gene expression and H3K27me3 appears to occur as a bistable domain with H3K4me3 in plastic genes. Surprisingly, silent and lowly expressed genes show low nucleosome occupancy suggesting that gene inactivation does not involve increased nucleosome occupancy and chromatin condensation. Due to a high occupancy of Pol II along highly expressed ORFs, transcriptional elongation appears to be quite different to other species. This is supported by missing heptameric repeats in the C-terminal domain of Pol II and a divergent elongation system. Our data implies that unoccupied DNA is the default state, whereas gene activation requires nucleosome recruitment together with broad domains of H3K4me3. This could represent a buffer for paused Pol II along ORFs in absence of elongation factors of higher eukaryotes.

Abstract Mitochondria dysfunction is involved in the pathomechanism of many illnesses including Parkinson’s disease. PINK1, which is mutated in some cases of familiar Parkinsonism, is a key component in the degradation of damaged mitochondria by mitophagy. The accumulation of PINK1 on the mitochondrial outer membrane (MOM) of compromised organelles is crucial for the induction of mitophagy, but the molecular mechanism of this process is still unresolved. Here, we investigate the association of PINK1 with the TOM complex. We demonstrate that PINK1 heavily relies on the import receptor TOM70 for its association with mitochondria and directly interacts with this receptor. The structural protein TOM7 appears to play only a moderate role in PINK1 association with the TOM complex, probably due to its role in stabilizing this complex. PINK1 requires the TOM40 pore lumen for its stable interaction with the TOM complex and apparently remains there during its further association with the MOM. Overall, this study provides new insights on the role of the individual TOM subunits in the association of PINK1 with the MOM of depolarized mitochondria.

Abstract Mitochondria derive the majority of their lipids from other organelles through contact sites. These lipids, primarily phosphoglycerolipids, are the main components of mitochondrial membranes. In the cell, neutral lipids like triacylglycerides (TAGs) are stored in lipid droplets, playing an important role in maintaining cellular health. Enzymes like lipases mobilize these TAGs according to cellular needs. Neutral lipids have not yet been reported to play an important role in mitochondria so the presence of a putative TAG lipase – Tgl2, in yeast mitochondria is surprising. Moreover, TGL2 and MCP2 , a high-copy suppressor for ERMES deficient cells, display genetic interactions suggesting a potential link to lipid metabolism. In this study, we characterize in detail Tgl2. We show that Tgl2 forms dimers through intermolecular disulfide bridges and a cysteine-dependent high molecular weight complex. Furthermore, we could identify the lipase motif and catalytic triad of Tgl2 through in silico comparison with other lipases and mutated the catalytically active residues accordingly. Both mutants failed to rescue the growth phenotype of mcp2 Δ /tgl2 Δ double deletion strain suggesting that the residues are indeed essential for the protein’s function. Additionally, we discovered that the catalytically active aspartate residue is important for protein stability. Steady state level analyses with non-functional variants of Tgl2 led to the identification of Yme1 as the protease responsible for its quality control. Finally, we provide evidence that the overall increase in TAGs in cells lacking Mcp2 and Tgl2 originates from the mitochondria. Collectively, our study provides new insights into a key player in mitochondrial lipid homeostasis.

Abstract Protein secretion begins with protein translocation through the universally conserved Sec61 channel in the endoplasmic reticulum (ER) membrane. The function of its β-subunit, called Sbh1 in yeast, remains poorly understood. Sbh1/Sec61β has a cytosolic domain consisting of two parts: the N-terminal approximately 40 amino acids are intrinsically unstructured, followed by a conserved membrane proximal (CMP) domain. Sbh1 is anchored to the Sec61 channel by a single C-terminal transmembrane domain. Phosphorylation of the Sbh1/Sec61β intrinsically unstructured domain allows regulated import of specific proteins into the ER. We show here that S3/T5 phosphorylation of Sbh1 results in a conformational change in the Sbh1 intrinsically unstructured N-terminus. We also address the function of the Sbh1/Sec61β CMP domain. We identify a potential interaction site in the Sbh1 CMP domain with the Sec61 N-terminal amphipathic helix using molecular dynamics (MD) modelling. Peptide panning revealed that the Sbh1 CMP domain contains a binding site for Sbh1-dependent signal peptides. Using site-directed mutagenesis, we show that the CMP region controls import of Sbh1-dependent translocation substrates into the ER. We conclude that the Sbh1 CMP domain functions as a gatekeeper that recognizes and guides specific substrates towards the Sec61 channel for insertion.

Alternative splicing is a potent modifier of protein function. Stromal interaction molecule 1 (Stim1) is the essential activator molecule of store-operated Ca2+ entry (SOCE) and a sorting regulator of certain ER proteins such as Stimulator of interferon genes (STING). Here, we characterize a conserved new variant, Stim1A, where splice-insertion translates into an additional C-terminal domain. We find prominent expression of exonA mRNA in testes, astrocytes, kidney and heart and confirm Stim1A protein in Western blot of testes. In situ , endogenous Stim1 with domain A, but not Stim1 without domain A localizes to unique adhesion junctions and to specialized membrane retrieval sites (tubulobulbar complexes) in testes. Functionally, using Ca2+ imaging and patch-clamp analysis, Stim1A shows a dominant-negative effect on SOCE and ICRAC, despite normal clustering and interaction with Orai1 investigated by combined TIRF and FRET analyses and as confirmed by an increased SOCE upon knock-down of endogenous Stim1A in astrocytes. Mutational analyses in conjunction with imaging and patch-clamp analyses of residues either in domain A or within the N-terminal region of Orai1 demonstrate a specific defect in stabilized channel gating. Our findings demonstrate that cell-type specific splicing of STIM1 adds both an intracellular targeting switch and adapts SOCE to meet the Ca2+ requirements of specific subcellular contact sites.