Extracellular vesicles (EVs), such as exosomes, can mediate long-distance communication between cells by delivering biomolecular cargo. It is speculated that EVs undergo back-fusion at multivesicular bodies (MVBs) in recipient cells to release their functional cargo. However, direct evidence is lacking. Tracing the cellular uptake of EVs with high resolution as well as acquiring direct evidence for the release of EV cargo is challenging mainly because of technical limitations. Here, we developed an analytical methodology, combining state-of-the-art molecular tools and correlative light and electron microscopy, to identify the intracellular site for EV cargo release. GFP was loaded inside EVs through the expression of GFP-CD63, a fusion of GFP to the cytosolic tail of CD63, in EV producer cells. In addition, we genetically engineered a cell line which expresses anti-GFP fluobody that specifically recognizes the EV cargo (GFP). Incubation of anti-GFP fluobody-expressing cells with GFP-CD63 EVs resulted in the formation of fluobody punctae, designating cytosolic exposure of GFP. Endosomal damage was not observed in EV acceptor cells. Ultrastructural analysis of the underlying structures at GFP/fluobody double-positive punctae demonstrated that EV cargo release occurs from endosomes/lysosomes. Finally, we show that neutralization of endosomal pH and cholesterol accumulation in endosomes leads to blockage of EV cargo exposure. In conclusion, we report that a fraction of internalized EVs fuse with the limiting membrane of endosomes/lysosomes in an acidification-dependent manner, which results in EV cargo exposure to the cell cytosol.

Abstract Understanding the structure of biomolecules is vital for deciphering their characteristics and roles in biological systems. While current structural analysis techniques like nuclear magnetic resonance and X-ray crystallography excel in many aspects, they fall short in capturing comprehensive single-molecule information. To address this limitation and to better capture the heterogeneity and dynamic range of biomolecular reactions, there is a need for single-molecule structural analysis tools. To achieve this, we introduce iMAX FRET, a one-pot FRET-based single-molecule method integrated with geometrical 3D reconstruction, offering comprehensive ab initio structural analysis. Through the stochastic exchange of fluorescent weak binders, iMAX FRET allows simultaneous assessment of multiple spatial coordinates on a biomolecule within a few minutes of time to generate distinct FRET fingerprints for 3D structural profiling. We demonstrate a mathematical approach for de novo structural prediction using iMAX data, opening avenues for native biomolecule analysis. Furthermore, this method facilitates the investigation of conformational changes in individual molecules, illuminating single-molecule structural dynamics. Our technique has the potential to emerge as a powerful approach to advance our understanding of biomolecular structures.

Summary A recent ground-breaking study suggested that small RNA from mammalian cells can undergo N-glycan modifications (termed glycoRNA) 1 . The discovery relied upon a metabolic glycan labeling strategy in combination with commonly used phase-separation-based RNA isolation. Following the reported procedure, we likewise identified an N-glycosylated species in the RNA fraction. However, our results suggest that the reported RNase sensitivity of the glycosylated species depends on the specific RNA purification method. This suggests the possibility of co-purifying unexpected RNase-insensitive N-glycoconjugates during glycoRNA isolation, hinting at the complex biochemical nature of glycoRNA. Our study underscores the need for further research to elucidate the structural and biochemical properties of glycoRNA.

Abstract Recent discoveries have shown the presence of RNA molecules on the cell surface, defying the traditional view that RNA only functions intracellularly. However, it is not well understood how cell-surface RNA (csRNA) is stably present on the plasma membrane and what functions it performs on the cell surface. By exploiting the RNA-sensing ability of TLR7 as a specific recombinant probe to detect csRNA and coupling it with a genome-wide CRISPR-Cas9-knockout screening to identify genes essential for csRNA presentation on cells, we identified heparan sulfate (HS) as a crucial factor for RNA presentation on cells. Using the TLR7 binding probe, cell surface proximity labelling revealed that csRNA associates mechanistically with a plethora of RNA-binding proteins, and these interactions are crucial for csRNA presentation. Moreover, csRNA modulates receptor-ligand interactions between poliovirus receptor (PVR) and killer cell immunoglobulin-like receptor 2DL5 (KIR2DL5) by acting as a co-binder, recruiting the latter to cell surface. We provide a mechanistic understanding of csRNA presentation and unveil a new layer of complexity in the csRNA-dictated regulation of cell surface receptor-ligand interactions.