Prognostically relevant RNA expression states exist in pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), but our understanding of their drivers, stability, and relationship to therapeutic response is limited.To examine these attributes systematically, we profiled metastatic biopsies and matched organoid models at single-cell resolution.In vivo, we identify a new intermediate PDAC transcriptional cell state and uncover distinct site-and state-specific tumor microenvironments (TMEs).Benchmarking models against this reference map, we reveal strong culture-specific biases in cancer cell transcriptional state representation driven by altered TME signals.We restore expression state heterogeneity by adding back in vivo-relevant factors and show plasticity in culture models.Further, we prove that non-genetic modulation of cell state can strongly influence drug responses, uncovering state-specific vulnerabilities.This work provides a broadly applicable framework for aligning cell states across in vivo and ex vivo settings, identifying drivers of transcriptional plasticity and manipulating cell state to target associated vulnerabilities.

SUMMARY Bulk transcriptomic studies have defined classical and basal-like gene expression subtypes in pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) that correlate with survival and response to chemotherapy; however, the underlying mechanisms that govern these subtypes and their heterogeneity remain elusive. Here, we performed single-cell RNA-sequencing of 23 metastatic PDAC needle biopsies and matched organoid models to understand how tumor cell-intrinsic features and extrinsic factors in the tumor microenvironment (TME) shape PDAC cancer cell phenotypes. We identify a novel cancer cell state that co-expresses basal-like and classical signatures, demonstrates upregulation of developmental and KRAS-driven gene expression programs, and represents a transitional intermediate between the basal-like and classical poles. Further, we observe structure to the metastatic TME supporting a model whereby reciprocal intercellular signaling shapes the local microenvironment and influences cancer cell transcriptional subtypes. In organoid culture, we find that transcriptional phenotypes are plastic and strongly skew toward the classical expression state, irrespective of genotype. Moreover, we show that patient-relevant transcriptional heterogeneity can be rescued by supplementing organoid media with factors found in the TME in a subtype-specific manner. Collectively, our study demonstrates that distinct microenvironmental signals are critical regulators of clinically relevant PDAC transcriptional states and their plasticity, identifies the necessity for considering the TME in cancer modeling efforts, and provides a generalizable approach for delineating the cell-intrinsic versus -extrinsic factors that govern tumor cell phenotypes.

Abstract Epistasis, commonly defined as the interaction between genetic loci, is known to play an important role in the phenotypic variation of complex traits. As a result, many statistical methods have been developed to identify genetic variants that are involved in epistasis, and nearly all of these approaches carry out this task by focusing on analyzing one trait at a time. Previous studies have shown that jointly modeling multiple phenotypes can often dramatically increase statistical power for association mapping. In this study, we present the “multivariate MArginal ePIstasis Test” (mvMAPIT) — a multi-outcome generalization of a recently proposed epistatic detection method which seeks to detect marginal epistasis or the combined pairwise interaction effects between a given variant and all other variants. By searching for marginal epistatic effects, one can identify genetic variants that are involved in epistasis without the need to identify the exact partners with which the variants interact — thus, potentially alleviating much of the statistical and computational burden associated with conventional explicit search-based methods. Our proposed mvMAPIT builds upon this strategy by taking advantage of correlation structure between traits to improve the identification of variants involved in epistasis. We formulate mvMAPIT as a multivariate linear mixed model and develop a multi-trait variance component estimation algorithm for efficient parameter inference and P -value computation. Together with reasonable model approximations, our proposed approach is scalable to moderately sized GWA studies. With simulations, we illustrate the benefits of mvMAPIT over univariate (or single-trait) epistatic mapping strategies. We also apply mvMAPIT framework to protein sequence data from two broadly neutralizing anti-influenza antibodies and approximately 2,000 heterogenous stock of mice from the Wellcome Trust Centre for Human Genetics. The mvMAPIT R package can be downloaded at https://github.com/lcrawlab/mvMAPIT .

Abstract Standard single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) pipelines nearly always include unsupervised clustering as a key step in identifying biologically distinct cell types. A follow-up step in these pipelines is to test for differential expression between the identified clusters. When algorithms over-cluster, downstream analyses will produce inflated P -values resulting in increased false discoveries. In this work, we present callback ( Cal i b r a ted C lustering via K nockoffs): a new method for protecting against over-clustering by controlling for the impact of reusing the same data twice when performing differential expression analysis, commonly known as “double-dipping”. Importantly, our approach can be applied to a wide range of clustering algorithms. Using real and simulated data, we show that callback provides state-of-the-art clustering performance and can rapidly analyze large-scale scRNA-seq studies, even on a personal laptop.

SUMMARY Efforts to cure BCR::ABL1 B cell acute lymphoblastic leukemia (Ph+ ALL) solely through inhibition of ABL1 kinase activity have thus far been insufficient despite the availability of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) with broad activity against resistance mutants. The mechanisms that drive persistence within minimal residual disease (MRD) remain poorly understood and therefore untargeted. Utilizing 13 patient-derived xenograft (PDX) models and clinical trial specimens of Ph+ ALL, we examined how genetic and transcriptional features co-evolve to drive progression during prolonged TKI response. Our work reveals a landscape of cooperative mutational and transcriptional escape mechanisms that differ from those causing resistance to first generation TKIs. By analyzing MRD during remission, we show that the same resistance mutation can either increase or decrease cellular fitness depending on transcriptional state. We further demonstrate that directly targeting transcriptional state-associated vulnerabilities at MRD can overcome BCR::ABL1 independence, suggesting a new paradigm for rationally eradicating MRD prior to relapse. Finally, we illustrate how cell mass measurements of leukemia cells can be used to rapidly monitor dominant transcriptional features of Ph+ ALL to help rationally guide therapeutic selection from low-input samples. HIGHLIGHTS Relapse after remission on TKI can harbor mutations in ABL1, RAS, or neither Mutations and development-like cell state dictate fitness in residual disease Co-targeting cell state and ABL1 markedly reduces MRD Biophysical measurements provide an integrative, rapid measurement of cell state