Ludmil Alexandrov, Michael Stratton and colleagues analyze 10,250 human cancer genomes from 36 cancer types to identify mutational signatures with clock-like properties. They identify two signatures with different mutation rates that show a correlation between age at diagnosis and number of mutations in most cancer types. During the course of a lifetime, somatic cells acquire mutations. Different mutational processes may contribute to the mutations accumulated in a cell, with each imprinting a mutational signature on the cell's genome. Some processes generate mutations throughout life at a constant rate in all individuals, and the number of mutations in a cell attributable to these processes will be proportional to the chronological age of the person. Using mutations from 10,250 cancer genomes across 36 cancer types, we investigated clock-like mutational processes that have been operating in normal human cells. Two mutational signatures show clock-like properties. Both exhibit different mutation rates in different tissues. However, their mutation rates are not correlated, indicating that the underlying processes are subject to different biological influences. For one signature, the rate of cell division may influence its mutation rate. This study provides the first survey of clock-like mutational processes operating in human somatic cells.

The accurate propagation of histone marks during chromosomal replication is proposed to rely on the tight coupling of replication with the recycling of parental histones to the daughter strands. Here, we show in the avian cell line DT40 that REV1, a key regulator of DNA translesion synthesis at the replication fork, is required for the maintenance of repressive chromatin marks and gene silencing in the vicinity of DNA capable of forming G-quadruplex (G4) structures. We demonstrate a previously unappreciated requirement for REV1 in replication of G4 forming sequences and show that transplanting a G4 forming sequence into a silent locus leads to its derepression in REV1-deficient cells. Together, our observations support a model in which failure to maintain processive DNA replication at G4 DNA in REV1-deficient cells leads to uncoupling of DNA synthesis from histone recycling, resulting in localized loss of repressive chromatin through biased incorporation of newly synthesized histones.

Abstract Somatic mutations in human cancers show unevenness in genomic distribution that correlate with aspects of genome structure and function. These mutations are, however, generated by multiple mutational processes operating through the cellular lineage between the fertilized egg and the cancer cell, each composed of specific DNA damage and repair components and leaving its own characteristic mutational signature on the genome. Using somatic mutation catalogues from 560 breast cancer whole-genome sequences, here we show that each of 12 base substitution, 2 insertion/deletion (indel) and 6 rearrangement mutational signatures present in breast tissue, exhibit distinct relationships with genomic features relating to transcription, DNA replication and chromatin organization. This signature-based approach permits visualization of the genomic distribution of mutational processes associated with APOBEC enzymes, mismatch repair deficiency and homologous recombinational repair deficiency, as well as mutational processes of unknown aetiology. Furthermore, it highlights mechanistic insights including a putative replication-dependent mechanism of APOBEC-related mutagenesis.

G-quadruplex (G4)-forming genomic sequences, including telomeres, represent natural replication fork barriers. Stalled replication forks can be stabilized and restarted by homologous recombination (HR), which also repairs DNA double-strand breaks (DSBs) arising at collapsed forks. We have previously shown that HR facilitates telomere replication. Here, we demonstrate that the replication efficiency of guanine-rich (G-rich) telomeric repeats is decreased significantly in cells lacking HR. Treatment with the G4-stabilizing compound pyridostatin (PDS) increases telomere fragility in BRCA2-deficient cells, suggesting that G4 formation drives telomere instability. Remarkably, PDS reduces proliferation of HR-defective cells by inducing DSB accumulation, checkpoint activation, and deregulated G2/M progression and by enhancing the replication defect intrinsic to HR deficiency. PDS toxicity extends to HR-defective cells that have acquired olaparib resistance through loss of 53BP1 or REV7. Altogether, these results highlight the therapeutic potential of G4-stabilizing drugs to selectively eliminate HR-compromised cells and tumors, including those resistant to PARP inhibition.

Acute treatment with replication-stalling chemotherapeutics causes reversal of replication forks. BRCA proteins protect reversed forks from nucleolytic degradation, and their loss leads to chemosensitivity. Here, we show that fork degradation is no longer detectable in BRCA1-deficient cancer cells exposed to multiple cisplatin doses, mimicking a clinical treatment regimen. This effect depends on increased expression and chromatin loading of PRIMPOL and is regulated by ATR activity. Electron microscopy and single-molecule DNA fiber analyses reveal that PRIMPOL rescues fork degradation by reinitiating DNA synthesis past DNA lesions. PRIMPOL repriming leads to accumulation of ssDNA gaps while suppressing fork reversal. We propose that cells adapt to repeated cisplatin doses by activating PRIMPOL repriming under conditions that would otherwise promote pathological reversed fork degradation. This effect is generalizable to other conditions of impaired fork reversal (e.g., SMARCAL1 loss or PARP inhibition) and suggests a new strategy to modulate cisplatin chemosensitivity by targeting the PRIMPOL pathway.

The APOBEC3 family of cytosine deaminases has been implicated in some of the most prevalent mutational signatures in cancer1-3. However, a causal link between endogenous APOBEC3 enzymes and mutational signatures in human cancer genomes has not been established, leaving the mechanisms of APOBEC3 mutagenesis poorly understood. Here, to investigate the mechanisms of APOBEC3 mutagenesis, we deleted implicated genes from human cancer cell lines that naturally generate APOBEC3-associated mutational signatures over time4. Analysis of non-clustered and clustered signatures across whole-genome sequences from 251 breast, bladder and lymphoma cancer cell line clones revealed that APOBEC3A deletion diminished APOBEC3-associated mutational signatures. Deletion of both APOBEC3A and APOBEC3B further decreased APOBEC3 mutation burdens, without eliminating them. Deletion of APOBEC3B increased APOBEC3A protein levels, activity and APOBEC3A-mediated mutagenesis in some cell lines. The uracil glycosylase UNG was required for APOBEC3-mediated transversions, whereas the loss of the translesion polymerase REV1 decreased overall mutation burdens. Together, these data represent direct evidence that endogenous APOBEC3 deaminases generate prevalent mutational signatures in human cancer cells. Our results identify APOBEC3A as the main driver of these mutations, indicate that APOBEC3B can restrain APOBEC3A-dependent mutagenesis while contributing its own smaller mutation burdens and dissect mechanisms that translate APOBEC3 activities into distinct mutational signatures.

Abstract Emerging SARS CoV-2 variants are creating major challenges in the ongoing Covid-19 pandemic. Predicting CoV-2 mutations that increase transmissibility or immune evasion would be extremely valuable in development of broad-acting therapeutics and vaccines and prioritising viral monitoring and containment. Using in vitro evolution, we identify a double mutation in CoV-2 receptor binding domain (RBD) that increases affinity for ACE2 almost 20-fold. We determine the mutant:ACE2 structure to reveal the binding mechanism and show the main affinity driver, Q498H, boosts binding of other RBD variants. We find this mutation incompatible with the common N501Y mutation, but N501Y variants can acquire Q498R to access a similar bonding network and affinity gain. We show Q498H, and Q498R plus N501Y, enable variants to bind rat ACE2 with high affinity. These mutations are now emerging in CoV-2 variants, such as the Omicron variant, where they would be expected to drive increased human-to-human and cross-species transmission.

Abstract Replication of the human genome initiates within broad zones of ~ 150 kb. The extent to which firing of individual DNA replication origins within initiation zones is spatially stochastic or localised at defined sites remains a matter of debate. A thorough characterisation of the dynamic activation of origins within initiation zones is hampered by the lack of a high-resolution map of both their position and efficiency. To address this shortcoming, we describe a modification of initiation site sequencing (ini-seq) based on density substitution. Newly-replicated DNA is rendered ‘heavy-light’ (HL) by incorporation of BrdUTP, unreplicated DNA remaining ‘light-light’ (LL). Replicated HL-DNA is separated from unreplicated LL-DNA by equilibrium density gradient centrifugation, then both fractions are subjected to massive parallel sequencing. This allows precise mapping of 23,905 replication origins simultaneously with an assignment of a replication initiation efficiency score to each. We show that origin firing within initiation zones is not randomly distributed. Rather, origins are arranged hierarchically with a set of very highly efficient origins marking zone boundaries. We propose that these origins explain much of the early firing activity arising within initiation zones, helping to unify the concept of replication initiation zones with the identification of discrete replication origin sites.

Abstract Background Short tandem repeats (STRs) contribute significantly to de novo mutagenesis, driving phenotypic diversity and genetic disease. Although highly diverse, their repetitive sequences induce DNA polymerase slippage and stalling, leading to length and sequence variation. However, current studies of DNA synthesis through STRs are restricted to a handful of selected sequences, limiting our broader understanding of their evolutionary behaviour and hampering the characterisation of the determinants of their abundance and stability in eukaryotic genomes. Results We perform a comprehensive analysis of DNA synthesis at all STR permutations and interrogate the impact of STR sequence and secondary structure on their genomic representation and mutability. To do so, we developed a high-throughput primer extension assay that allows monitoring of the kinetics and fidelity of DNA synthesis through 20,000 sequences comprising all STR permutations in different lengths. By combining these measurements with population-scale genomic data, we show that the response of a model replicative DNA polymerase to variously structured DNA is sufficient to predict the complex genomic behaviour of STRs, including abundance and mutational constraints. We demonstrate that DNA polymerase stalling at DNA structures induces error-prone DNA synthesis, which constrains STR expansion. Conclusions Our data support a model in which STR length in eukaryotic genomes results from a balance between expansion due to polymerase slippage at repeated DNA sequences and point mutations caused by error-prone DNA synthesis at DNA structures.

Regions of the genome with the potential to form secondary structure pose a frequent and significant impediment to DNA replication and must be actively managed in order to preserve genetic and epigenetic integrity. The fork protection complex (FPC), a conserved group of replisome-associated proteins including Timeless, Tipin, and Claspin, plays an important role in maintaining efficient replisome activation, ensuring optimum fork rates, sister chromatid cohesion and checkpoint function. It also helps maintain the stability of sequences prone to secondary structure formation through an incompletely understood mechanism. Here, we report a previously unappreciated DNA binding domain in the C-terminus of Timeless, which exhibits specific binding to G quadruplex (G4) structures. We show that, in vivo, both the C-terminus of Timeless and the DDX11 helicase act collaboratively to ensure processive replication of G4 structures to prevent genetic and epigenetic instability.