Abstract Cryo-soft-X-ray tomography is being increasingly used in biological research to study the morphology of cellular compartments and how they change in response to different stimuli, such as viral infections. Segmentation of these compartments is limited by time-consuming manual tools or machine learning algorithms that require extensive time and effort to train. Here we describe Contour , a new, easy-to-use, highly automated segmentation tool that enables accelerated segmentation of tomograms to delineate distinct cellular compartments. Using Contour , cellular structures can be segmented based on their projection intensity and geometrical width by applying a threshold range to the image and excluding noise smaller in width than the cellular compartments of interest. This method is less laborious and less prone to errors from human judgement than current tools that require features to be manually traced, and does not require training datasets as would machine-learning driven segmentation. We show that high-contrast compartments such as mitochondria, lipid droplets, and features at the cell surface can be easily segmented with this technique in the context of investigating herpes simplex virus 1 infection. Contour can extract geometric measurements from 3D segmented volumes, providing a new method to quantitate cryo-soft-X-ray tomography data. Contour can be freely downloaded at github.com/kamallouisnahas/Contour . Impact Statement More research groups are using cryo-soft-X-ray tomography as a correlative imaging tool to study the ultrastructure of cells and tissues but very few tomograms are segmented with existing segmentation programs. Segmentation is usually a prerequisite for measuring the geometry of features in tomograms but the time- and labour-intensive nature of current segmentation techniques means that such measurements are rarely across a large number of tomograms, as is required for robust statistical analysis. Contour has been designed to facilitate the automation of segmentation and, as a result, reduce manual effort and increase the number of tomograms that can be segmented. Because it requires minimal manual intervention, Contour is not as prone to human error as programs that require the users to trace the edges of cellular features. Geometry measurements of the segmented volumes can be calculated using this program, providing a new platform to quantitate cryoSXT data. Contour also supports quantitation of volumes imported from other segmentation programs. The generation of a large sample of segmented volumes with Contour that can be used as a representative training dataset for machine learning applications is a long-term aspiration of this technique.

Abstract Herpes simplex virus-1 (HSV-1) is a large, enveloped DNA virus and its assembly in the cell is a complex multi-step process during which viral particles interact with numerous cellular compartments such as the nucleus and organelles of the secretory pathway. Transmission electron microscopy and fluorescence microscopy are commonly used to study HSV-1 infection. However, 2D imaging limits our understanding of the 3D geometric changes to cellular compartments that accompany infection and sample processing can introduce morphological artefacts that complicate interpretation. In this study, we used soft X-ray tomography to observe differences in whole-cell architecture between HSV-1 infected and uninfected cells. To protect the near-native structure of cellular compartments we used a non-disruptive sample preparation technique involving rapid cryopreservation, and a fluorescent reporter virus was used to facilitate correlation of structural changes with the stage of infection in individual cells. We observed viral capsids and assembly intermediates interacting with nuclear and cytoplasmic membranes. Additionally, we observed differences in the morphology of specific organelles between uninfected and infected cells. The local concentration of cytoplasmic vesicles at the juxtanuclear compartment increased and their mean width decreased as infection proceeded, and lipid droplets transiently increased in size. Furthermore, mitochondria in infected cells were elongated and highly branched, suggesting that HSV-1 infection alters the dynamics of mitochondrial fission/fusion. Our results demonstrate that high-resolution 3D images of cellular compartments can be captured in a near-native state using soft X-ray tomography and have revealed that infection causes striking changes to the morphology of intracellular organelles. Importance Ultrastructural changes to the morphology and organization of cellular compartments during herpes simplex virus-1 (HSV-1) infection have not previously been studied under near-physiological conditions. In this study, soft X-ray tomography was used to image the ultrastructure of vitrified cells during HSV-1 infection, identifying striking changes to the abundance and organization of cytoplasmic vesicles and mitochondria. The concentration of vesicles in the juxtanuclear region increased with time post infection, which could represent an increasing supply of vesicles to support capsid envelopment, and there is a transient increase in the size of lipid droplets in infected cells. Furthermore, we show that mitochondria elongate and form highly-branched networks as infection progresses. These findings offer insight into stages of virion morphogenesis and the cellular response to infection, highlighting the utility of cryo-soft-X-ray tomography for monitoring the near-native state ultrastructure of infected cells.

Abstract Numerous viral genes are involved in assembly of herpes simplex virus-1 (HSV-1), but their relative importance and function remain poorly characterised. Transmission electron microscopy has been used to study viral protein function in cells infected with HSV-1 mutants; however, these studies were usually conducted without correlative light microscopy to identify specific viral components. In this study, fluorescent capsid (eYFP-VP26) and envelope (gM-mCherry) proteins were imaged by structured illumination microscopy under cryogenic conditions (cryoSIM) and cellular ultrastructure was captured from the same infected cells using cryo-soft-X-ray tomography (cryoSXT). Nine fluorescent HSV-1 mutants, each lacking a different viral protein, were compared to assess the importance of viral proteins in different stages of HSV-1 morphogenesis. The relative importance of five viral proteins to nuclear egress were ranked (pUL34 > pUL21 > VP16 > pUL16 > pUS3) according to the levels of attenuation observed for each virus. Correlative imaging also revealed the roles of five viral proteins in cytoplasmic envelopment. VP16 was found to be important in capsid delivery to envelopment compartments, while cytoplasmic clusters of virus particles plus features of stalled envelopment not previously described were observed in the absence of pUL11, pUL51, gK, and gE. Finally, this 3D imaging approach was used to capture different assembly stages during cytoplasmic envelopment and to determine that envelopment occurs by particle budding rather than wrapping. The findings demonstrate that tomographic 3D correlative imaging is an emerging technology that sheds new light on viral protein functions and virion morphogenesis. Importance To date, the characterisation of HSV-1 mutants in the study of virus assembly has been limited to transmission electron microscopy (TEM) without the addition of correlative light microscopy to identify fluorescently labelled viral proteins. In addition, only a small number of mutants are typically used in each study. Herein, a comparative analysis of nine HSV-1 mutants lacking specific structural proteins was performed using correlative fluorescence microscopy and X-ray tomography for the first time, revealing the relative roles of each viral protein in virus assembly. pUL16 and pUL21 were shown to be important in nuclear egress of HSV-1, and we found that VP16 promotes nuclear egress and delivery of capsids to cytoplasmic envelopment compartments. pUL11, pUL51, gK, and gE were also shown to have important roles in cytoplasmic envelopment, with the loss of their functions leading to various stalled cytoplasmic envelopment phenotypes involving polarised arrays of capsids at one side of cytoplasmic vesicles that to our knowledge have never been seen with TEM. This correlative imaging approach enabled the study of cytoplasmic envelopment in 3D, revealing an envelopment mechanism driven by capsid budding rather than membrane wrapping. By providing novel and comparative insights into the roles of different viral proteins in various stages of HSV-1 assembly, these findings highlight the utility of correlative cryo-fluorescence plus cryo-soft-X-ray tomography for probing trajectories of intracellular pathogen assembly.