Abstract Convergent evolution provides unparalleled insights into the selective drivers underlying evolutionary change. While snakes use venom primarily for predation, and venom composition often reflects diet specificity, three lineages of spitting cobras have independently evolved the ability to use venom as a defensive projectile. Using gene, protein and functional analyses, we show that the three spitting lineages possess venom characterized by an upregulation of PLA 2 toxins, which potentiate the action of venom cytotoxins to activate mammalian sensory neurons and cause enhanced pain. These repeated independent changes provide a fascinating example of convergent evolution across multiple phenotypic levels driven by exaptations. Notably, the timing of their origins suggests that defensive venom spitting may have evolved in response to the emergence of bipedal hominids in Africa and Asia. One Sentence Summary Venom spitting by snakes coincides with the emergence of hominins and is underpinned by convergent increases in pain-enhancing toxins

Abstract Background Variation in snake venoms is well documented, both between and within species, with intraspecific venom variation often correlated with geographically distinct populations. The puff adder, Bitis arietans , is found widely distributed across sub-Saharan Africa and into the Arabian Peninsula where it is considered a leading cause of the ∼310,000 annual snakebites across the region, with its venom capable of causing substantial morbidity and mortality. Despite its medical importance and wide geographic distribution, there is little known about venom variation between different B. arietans populations and the potential implications of this variation on antivenom efficacy. Methodology We applied a range of analyses, including venom gland transcriptomics, in vitro enzymatic assays and reverse phase chromatography to comparatively analyse B. arietans venoms originating from Nigeria, Tanzania, and South Africa. Immunological assays and in vitro enzymatic neutralisation assays were then applied to investigate the impact of venom variation on the potential efficacy of three antivenom products; SAIMR Polyvalent, EchiTAb-Plus and Fav-Afrique. Findings Through the first comparison of venom gland transcriptomes of B. arietans from three geographically distinct regions (Nigeria, Tanzania, and South Africa), we identified substantial variation in toxin expression. Findings of venom variation were further supported by chromatographic venom profiling, and the application of enzymatic assays to quantify the activity of three pathologically relevant toxin families. However, the use of western blotting, ELISA, and in vitro enzymatic inhibition assays revealed that variation within B. arietans venom does not appear to substantially impact upon the efficacy of three African polyvalent antivenoms. Conclusions The large distribution and medical importance of B. arietans makes this species ideal for understanding venom variation and the impact this has on therapeutic efficacy. The findings in this study highlight the likelihood for considerable venom toxin variation across the range of B. arietans, but that this may not dramatically impact upon the utility of treatment available in the region. Author Summary The puff adder ( Bitis arietans ) is found across sub-Saharan Africa and the Arabian Peninsula and is capable of causing life threatening pathology due to its potent venom. The extensive range of B. arietans exposes populations to different ecological pressures which may impact upon the composition of venom toxins. In this study, we examined the venom composition of B. arietans from three countries separated by large geographic distance: Nigeria, Tanzanian and South Africa. By integrating venom gland transcriptomes, venom chromatography, and in vitro functional assays to profile B. arietans venom composition, we uncovered extensive variation between the three locales. Given that venom variation can have a significant impact on the efficacy of antivenom treatment, we also investigated the ability of three African antivenoms to recognise and inhibit in vitro venom activity. Through these analyses, we were able to determine that venom variation did not have a substantial impact on the neutralising effect of selected antivenoms. This study has highlighted the potentially extensive venom variation found across the range of B. arietans and initiated valuable investigations into the efficacy of African antivenoms to protect human populations vulnerable to snakebite envenoming.

Abstract Snakebite envenoming is a global public health issue that causes significant morbidity and mortality, particularly in low-income regions of the world. The clinical manifestations of envenomings vary depending on the snake’s venom, with paralysis, haemorrhage, and necrosis being the most common and medically relevant effects. To assess the efficacy of antivenoms against dermonecrosis, a preclinical testing approach involves in vivo mouse models that mimic local tissue effects of cytotoxic snakebites in humans. However, current methods for assessing necrosis severity are time-consuming and susceptible to human error. To address this, we present the Venom Induced Dermonecrosis Analysis tool (VIDAL), a machine-learning-guided image-based solution that can automatically identify dermonecrotic lesions in mice, adjust for lighting biases, scale the image, extract lesion area and discolouration, and calculate the severity of dermonecrosis. We also introduce a new unit, the dermonecrotic unit (DnU), to better capture the complexity of dermonecrosis severity. Our tool is comparable to the performance of state-of-the-art histopathological analysis, making it an accessible, accurate, and reproducible method for assessing dermonecrosis. Given the urgent need to address the neglected tropical disease that is snakebite, high-throughput technologies such as VIDAL are crucial in developing and validating new and existing therapeutics for this debilitating disease.