Abstract African swine fever (ASF) is highly contagious, causes high mortality in domestic and feral swine, and has a significant economic impact on the global swine industry due to the lack of a vaccine or an effective treatment. African swine fever virus (ASFV) encodes more than 150 polypeptides, which may have intricate and delicate interactions with the host for the benefit of the virus to evade the host’s defenses. However, currently, there is still a lack of information regarding the roles of the viral proteins in host cells. Here, our data demonstrated that the p17, encoded by D117L gene could suppress porcine cGAS-STING signaling pathway, exhibiting the inhibitions of TBK1 and IRF3 phosphorylations, downstream promoter activities, cellular mRNA transcriptions and ISG56 induction, and antiviral responses. Further, we found that p17 was located in endoplasmic reticulum (ER) and Golgi apparatus, and interacted with STING, perturbing it in the recruitment of TBK1 and IKKε. Additionally, it appeared that the transmembrane domain (amino acids 39–59) of p17 could be required for interacting with STING and inhibiting cGAS-STING pathway. Taken together, p17 could inhibit the cGAS-STING pathway through its interaction with STING and interference with STING in the recruitment of TBK1 and IKKε. Importance African swine fever (ASF) is a highly contagious disease in domestic and feral swine, posing significant economic impacts on the global swine industry, and the pathogen ASFV is a large icosahedral DNA virus. The innate immune cGAS-STING DNA sensing pathway plays a critical role in sensing invading ASFV and triggering antiviral responses. However, there is still a lack of information regarding the molecular mechanisms of ASFV evasion of the cGAS-STING pathway. We have analyzed the effects of whole genomic open reading frames (ORFs) of ASFV China 2018/1 on the activation of cGAS-STING pathway, and found that p17 was able to inhibit cGAS-STING mediated type I IFN production by targeting STING, altering its capacity to recruit both TBK1 and IKKε. Findings presented here will expand our knowledge on the molecular mechanisms by which ASFV counteracts the antiviral innate immunity and provide deep insights into ASF pathogenesis.

Abstract African swine fever virus (ASFV), a large and complex cytoplasmic double-stranded DNA virus, has developed multiple strategies to evade the antiviral innate immune responses. Cytosolic DNA arising from invading ASFV is mainly detected by the cyclic GMP-AMP synthase (cGAS) and then triggers a series of innate immune responses to prevent virus invasion. However, the immune escape mechanism of ASFV remains to be fully clarified. The pS273R of ASFV is a member of the SUMO-1-specific protease family and is crucial for valid virus replication. In this study, we identified pS273R as a suppressor of cGAS-STING pathway mediated type I interferon (IFN) production by ASFV genomic open reading frame screening. The pS273R was further confirmed as an inhibitor of IFN production as well as its downstream antiviral genes in cGAS-STING pathway. Mechanistically, pS273R greatly decreased the cGAS-STING signaling by targeting IKKε but not TBK1 and pS273R was found to disturb the interaction between IKKε and STING through its interaction with IKKε. Further, mutational analyses revealed that pS273R antagonized the cGAS-STING pathway by enzyme catalytic activity, which may affect the IKKε sumoylation state required for the interaction with STING. In summary, our results revealed for the first time that pS273R acts as an obvious negative regulator of cGAS-STING pathway by targeting IKKε via its enzymatic activity, which shows a new immune evasion mechanism of ASFV. Importance African swine fever (ASF) is a devastating disease for domestic pigs and wild boar and the pathogen ASFV is a cytoplasmic double-stranded DNA virus. The innate immune cGAS-STING-IFN signaling pathway exerts a critical role in sensing ASFV infection. However, the functions of half ASFV encoded 150 plus proteins are still unknown and the evasion against the cGAS-STING pathway is not resolved. In our study, via ASFV genomic open reading frame (ORF) screening, we found that 29 ASFV proteins could inhibit cGAS-STING signaling pathway, with pS273R showing the most obvious inhibitory effect. Surprisingly, pS273R was found to antagonize the cGAS-STING signaling by targeting IKKε. Moreover, the pS273R enzyme activity is required for its ability to inhibit the cGAS-STING pathway. Our findings deepen the understanding of the immune evasion mechanism of ASFV, which will provide a support for the development of safe and effective ASFV vaccines.

Abstract The innate immune DNA sensing cGAS-STING pathway exerts strong antiviral activity through the downstream interferon (IFN) production; however, it has been recently recognized that IFN independent activity of STING also plays an important role in antiviral functions. Nevertheless, the IFN independent antiviral activity of STING is not fully understood. In this study, we showed that porcine STING (pSTING) played a critical role in anti-HSV1 and anti-VSV infections, and IFN defective mutants including pSTING pLxIS sub, S365A and ΔCTT all exhibited similar antiviral functions to wild type (WT) pSTING. Further, all these IFN defective pSTING mutants possessed a comparable autophagy activity relative to WT pSTING as expected. From pSTING WT, S365A and ΔCTT, the residues responsible for autophagy were mutated, which included L333A/R334A, Y167A/L170A and Y245A/L248A, respectively. Surprisingly, all these autophagy defective pSTING mutants still resisted from the two viral infections, demonstrating the pSTING antiviral function independent of IFN as well as autophagy. On the other hand, all the autophagy defective pSTING mutants triggered cell apoptosis, which was associated with the antiviral functions. Additionally, pSTING lost its antiviral activity in TBK1 -/- and IRF3 -/- porcine macrophages, indicating the involvement of TBK1 and IRF3 in other STING activity such as apoptosis. Collectively, our results revealed that STING exerts both IFN and autophagy independent antiviral activity, and also suggested that STING triggered cell apoptosis might resist from virus infections.

Abstract Intraepithelial lymphocytes (IEL) expressing the γδ T cell receptor (TCR) survey the intestinal epithelium to limit the invasion of microbial pathogens. The production of type I interferon (IFN) is a central component of an antiviral immune response, yet how these pro-inflammatory cytokines contribute to γδ IEL effector function remains unclear. Based on the unique activation status of IELs, and their ability to bridge innate and adaptive immunity, we investigated the extent to which type I IFN signaling modulates γδ IEL function. Using an ex vivo culture model, we find that type I IFN alone is unable to drive IFNγ production, yet low level TCR activation synergizes with type I IFN to induce IFNγ production in murine γδ IELs. Further investigation into the underlying molecular mechanisms of co-stimulation revealed that TCRγδ-mediated activation of NFAT and JNK is required for type I IFN to promote IFNγ expression in a STAT4- dependent manner. Whereas type I IFN rapidly upregulates antiviral gene expression independent of a basal TCRγδ signal, neither tonic TCR triggering nor the presence of a TCR agonist was sufficient to elicit type I IFN-induced IFNγ production in vivo . However, bypassing proximal TCR signaling events synergized with IFNAR/STAT4 activation to induce γδ IEL IFNγ production. These findings indicate that γδ IELs contribute to host defense in response to type I IFN by mounting a rapid antimicrobial response independent of TCRγδ signaling, and under permissive conditions, produce IFNγ in a TCR-dependent manner.

Abstract Intraepithelial lymphocytes expressing the γδ T cell receptor (γδ IELs) serve as a first line of defense against luminal microbes. Although the presence of an intact microbiota is dispensable for γδ IEL development, several microbial factors contribute to the maintenance of this sentinel population. However, whether specific commensals influence population of the γδ IEL compartment under homeostatic conditions has yet to be determined. We identified a novel γδ IEL hyperproliferative phenotype that arises early in life and is characterized by expansion of multiple Vγ subsets. Horizontal transfer of this hyperproliferative phenotype to mice harboring a phenotypically normal γδ IEL compartment was prevented following antibiotic treatment, thus demonstrating that the microbiota is both necessary and sufficient for the observed increase in γδ IELs. Further, we identified a group of unique gut bacteria represented by 5 amplicon sequence variants (ASV) which are strongly associated with γδ IEL expansion. Using intravital microscopy, we find that hyperproliferative γδ IELs also exhibit increased migratory behavior leading to enhanced protection against bacterial infection. These findings reveal that transfer of a specific group of commensals can regulate γδ IEL homeostasis and immune surveillance, which may provide a novel means to reinforce the epithelial barrier.