Epidemiological studies have revealed the emergence of multiple SARS-CoV-2 variants of concern (VOC), including the lineage B.1.1.7 that is rapidly replacing old variants. The B.1.1.7 variant has been linked to increased morbidity rates, transmissibility, and potentially mortality (1). To assess viral fitness in vivo and to address whether the B.1.1.7 variant is capable of immune escape, we conducted infection and re-infection studies in naïve and convalescent Syrian hamsters (>10 months old). Hamsters infected by either a B.1.1.7 variant or a B.1 (G614) variant exhibited comparable viral loads and pathology. Convalescent hamsters that were previously infected by the original D614 variant were protected from disease following B.1.1.7 challenge with no observable clinical signs or lung pathology. Altogether, our study did not find that the B.1.1.7 variant significantly differs from the B.1 variant in pathogenicity in hamsters and that natural infection-induced immunity confers protection against a secondary challenge by the B1.1.7 variant.

ABSTRACT Hyperimmune immunoglobulin (hCoV-2IG) preparations generated from SARS-CoV-2 convalescent plasma (CP) are under evaluation in several clinical trials of hospitalized COVID-19 patients. Here we explored the antibody epitope repertoire, antibody binding and virus neutralizing capacity of six hCoV-2IG batches as well as nine convalescent plasma (CP) lots against SARS-CoV-2 and emerging variants of concern (VOC). The Gene-Fragment Phage display library spanning the SARS-CoV-2 spike demonstrated broad recognition of multiple antigenic sites spanning the entire spike including NTD, RBD, S1/S2 cleavage site, S2-fusion peptide and S2-heptad repeat regions. Antibody binding to the immunodominant epitopes was higher for hCoV-2IG than CP, with predominant binding to the fusion peptide. In the pseudovirus neutralization assay (PsVNA) and in the wild-type SARS-CoV-2 PRNT assay, hCoV-2IG lots showed higher titers against the WA-1 strain compared with CP. Neutralization of SARS-CoV-2 VOCs from around the globe were reduced to different levels by hCoV-2IG lots. The most significant loss of neutralizing activity was seen against the B.1.351 (9-fold) followed by P.1 (3.5-fold), with minimal loss of activity against the B.1.17 and B.1.429 (≤2-fold). Again, the CP showed more pronounced loss of cross-neutralization against the VOCs compared with hCoV-2IG. Significant reduction of hCoV-2IG binding was observed to the RBD-E484K followed by RBD-N501Y and minimal loss of binding to RBD-K417N compared with unmutated RBD. This study suggests that post-exposure treatment with hCoV-2IG is preferable to CP. In countries with co-circulating SARS-CoV-2 variants, identifying the infecting virus strain could inform optimal treatments, but would likely require administration of higher volumes or repeated infusions of hCOV-2IG or CP, in patients infected with the emerging SARS-CoV-2 variants.

Abstract Members of Flavivirus , a genus of Flaviviridae , encompass numerous enveloped plus strand RNA viruses, of which globally dengue virus (DENV) is the leading cause of serious arthropod-borne disease. The genomes of DENV, just as those of yellow fever virus (YFV), West Nile fever virus (WNV), or Zika virus (ZIKV), control their translation by a 5’-terminal capping group. Three other genera of Flaviviridae are remarkable because their viruses use internal ribosomal entry sites (IRESs) to control translation and they are not arthropod transmitted. In 2006 E. Harris’ group published work suggesting that DENV RNA does not stringently need a cap for translation. They proposed that instead DENV translation is controlled by an interplay between 5’ and 3’ termini. Here we present evidence that the DENV or ZIKV 5’-untranslated regions (5’-UTRs) alone have IRES competence. This conclusion is based, first, on the observation that uncapped mono-cistronic mRNAs 5’ terminated with the DENV or ZIKV 5’-UTRs can efficiently direct translation of a reporter gene in BHK and C6/36 cells; second, that either 5’-UTR placed between two reporter genes can efficiently induce expression of the downstream gene in BHK but not in C6/36 cells. These experiments followed observations that uncapped DENV/ZIKV genomic transcripts, 5’ terminated with pppAN… or GpppAN…, can initiate infections of mammalian (BHK) or mosquito (C6/36) cells. IRES competence of the 5’-UTRs of DENV/ZIKV raises many open questions regarding the biology and control, as well as the evolution, of insect-borne flaviviruses. Importance Members of the genus Flavivirus of Flaviviridae are important human pathogens of great concern because they cause serious diseases, sometimes death, in human populations living in tropical, subtropical (dengue, DENV; Zika, ZIKV; yellow fever virus), or moderate climates (West Nile virus). Flaviviruses are known to control their translation by a cap-dependent mechanism. We have observed, however, that the uncapped genomes of DENV or ZIKV can initiate infection of mammalian and insect cells. We provide evidence that the short 5’ untranslated region (5’-UTR) of DENV or ZIKV genomes can fulfill the function of an internal ribosomal entry site (IRES). This strategy frees these organisms from the cap-dependent mechanism of gene expression at an as yet unknown stage of proliferation. The data raise new questions about the biology and evolution of flaviviruses, possibly leading to new controls of flavivirus disease.

Abstract Antigenic assessments of SARS-CoV-2 variants inform decisions to update COVID-19 vaccines. Primary infection sera are often used for assessments, but such sera are rare due to population immunity from SARS-CoV-2 infections and COVID-19 vaccinations. Here, we show that neutralization titers and breadth of matched human and hamster pre-Omicron variant primary infection sera correlate well and generate similar antigenic maps. The hamster antigenic map shows modest antigenic drift among XBB sub-lineage variants, with JN.1 and BA.4/BA.5 variants within the XBB cluster, but with five to six-fold antigenic differences between these variants and XBB.1.5. Compared to sera following only ancestral or bivalent COVID-19 vaccinations, or with post-vaccination infections, XBB.1.5 booster sera had the broadest neutralization against XBB sub-lineage variants, although a five-fold titer difference was still observed between JN.1 and XBB.1.5 variants. These findings suggest that antibody coverage of antigenically divergent JN.1 could be improved with a matched vaccine antigen.

Abstract Herein we describe a previously uninvestigated salivary gland escape barrier (SEB) in Culex tarsalis mosquitoes infected with two different strains of Western equine encephalitis virus (WEEV). The WEEV strains were originally isolated either from mosquitoes (IMP181) or a human patient (McMillan). Both IMP181 and McMillan viruses were fully able to infect the salivary glands of Culex tarsalis after intrathoracic injection as determined by expression of mCherry fluorescent protein. IMP181, however, was better adapted to transmission as measured by virus titer in saliva as well as transmission rates in infected mosquitoes. We used chimeric recombinant WEEV strains to show that inclusion of IMP181-derived structural genes partially circumvents the SEB. Author Statement During the first half of the previous century, WEEV was responsible for large outbreaks throughout the northern United States and Canada that caused severe disease in horses and people. Over the past 60 years, cases of WEEV have mysteriously faded and the pathogen is rarely encountered in the clinic today. Salivary gland escape barriers (SEB) are a relatively neglected field of study in arbovirology, and this study provides a valuable contribution to the field by describing a SEB found in otherwise vector competent Culex tarsalis mosquitoes. Although midgut barriers are well studied, less is known about barriers to transmission in the salivary glands. Although salivary gland infection occurs at a high rate following direct injection of virus into the hemocoel, we noticed that only ∼20-30% of infected mosquitoes transmit detectable infectious virus in their saliva. Additionally, although the more pathogenic patient-derived McMillan strain of WEEV infected salivary glands at a similar rate, its transmission was more severely restricted than the mosquito-derived but less pathogenic Imperial 181 strain. We were able to trace determinants of viral transmission to the 6K/E1 region of the gene encoding the viral structural polyprotein. WEEV is a valuable research model for the closely related Eastern equine encephalitis virus and Venezuelan equine encephalitis virus we believe that our findings are applicable to other members of Togaviridae .

Abstract Continuous evolution of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) will likely force more future updates of vaccine composition. Based on a series of studies carried out in human ACE2 transgenic mice (K18-hACE2) and Syrian hamsters, we show that immunity at the respiratory tract, acquired through either previous infection or vaccination with an in-house live attenuate virus, offers protection against antigenically distinct variants in the absence of variant spike-specific neutralizing antibodies. Interestingly, immunity acquired through infection of a modern variant (XBB.1.5) was insufficient in preventing brain infection by the ancestral virus (WA1/2020) in K18-hACE2 mice. Similarly, previous infection with WA1/2020 did not protect against brain infection by XBB.1.5. Our results highlight the importance of immune components other than neutralizing antibodies in maintaining protection against new variants in the respiratory tract, but also paint scenarios where a monovalent vaccine based on a contemporary variant may be less effective against the ancestral strain. Importance Many studies have assessed the cross neutralization of various SARS-CoV-2 variants induced by breakthrough infections or vaccine boosters. Few studies, however, have modeled a more severe type of breakthrough infection. Here, we show that immunity acquired through a previous infection by either a historical virus (WA1/2020) or a contemporary variant (XBB.1.5) failed to protect against brain infection of K18-hACE2 mice by an antigenically distinct virus, although it largely protected the respiratory tract. Our results provided a potential model to investigate the role of different immune components in curbing SARS-CoV-2 infection.

Abstract The SARS-CoV-2 spike glycoprotein has 22 potential N-linked glycosylation sites per monomer that are highly conserved among diverse variants, but how individual glycans affect virus entry and neutralization of Omicron variants has not been extensively characterized. Here we compared the effects of specific glycan deletions or modifications in the Omicron BA.1 and D614G spikes on spike expression, processing, and incorporation into pseudoviruses, as well as on virus infectivity and neutralization by therapeutic antibodies. We found that loss of potential glycans at spike residues N717 and N801 each conferred a loss of pseudovirus infectivity for Omicron but not for D614G or Delta variants. This decrease in infectivity correlated with decreased spike processing and incorporation into Omicron pseudoviruses. Oligomannose-enriched Omicron pseudoviruses generated in GnTI - cells or in the presence of kifunensine were non-infectious, whereas D614G or Delta pseudoviruses generated under similar conditions remained infectious. Similarly, authentic SARS-CoV-2 grown in the presence of kifunensine decreased titers more for the BA.1.1 variant than Delta or D614G variants relative to their respective, untreated controls. Finally, we found that loss of some N-glycans, including N343 and N234, increased the maximum percent neutralization by the class 3 S309 monoclonal antibody against D614G but not BA.1 variants, while these glycan deletions altered the neutralization potency of the class 1 COV2-2196 and Etesevimab monoclonal antibodies without affecting maximum percent neutralization. The maximum neutralization by some antibodies also varied with the glycan composition, with oligomannose-enriched pseudoviruses conferring the highest percent neutralization. These results highlight differences in the interactions between spike glycans and residues among SARS-CoV-2 variants that can affect spike expression, virus infectivity, and susceptibility of variants to antibody neutralization. Author summary (non-technical) The SARS-CoV-2 spike surface protein is covered in glycans that may affect its function and ability to evade antibodies. Omicron variants have over 30 mutations compared to the D614G variant, yet all 22 potential N-glycosylation sites are highly conserved. Here we compared the impact of glycan changes in the spikes of the Omicron and D614G variants on virus infectivity and neutralization. We found that loss of specific glycans in the transmembrane subunit of spike greatly reduced Omicron, but not D614G, spike expression and incorporation into pseudoviruses. Changes in the overall glycan composition also reduced the infectivity of Omicron pseudovirus and authentic virus more than D614G pseudoviruses and authentic viruses. We further show that changes in specific glycans directly or indirectly affected susceptibility of pseudoviruses to therapeutic antibodies, but the effects differed among the variants. These findings highlight differences in the interplay between spike glycans and amino acid residues among SARS-CoV-2 variants that can contribute to spike plasticity and modify spike expression, function, and immune evasion properties.

The sequence of Zika virus has evolved as it has spread out of Africa and into the Americas. It is unclear whether American strains of the virus define a new serotype. Here, we have tested the virulence and immunogenicity of three wild-type ZIKV strains in neonatal Swiss Webster mice. We found that all three ZIKV strains (African MR766, 1947; Asian FSS13025, 2010; and American, PRVABC59, 2015) are capable of killing neonatal mice after intracranial injection. Intraperitoneal injection with these viruses did not kill, but produced neutralizing antibodies as measured by a PRNT50 assay. Sera from mice infected with each virus were tested for neutralizing activity against the infecting virus and also the other two viruses by a PRNT50 assay. In general, the antibodies induced by each virus were good at neutralizing that virus (the homologous virus), but somewhat poorer at neutralizing the other two viruses (heterologous viruses). Antibodies induced by the African strain MR766 were about 4-fold worse at neutralizing the American strain PRVABC59 than the homologous strain, while antibodies induced by the American strain were about 10-fold worse at neutralizing the African strain than the homologous strain. Because the antibodies are cross-neutralizing at some level, the viruses do not form separate serotypes. Nevertheless, these results raise concern that the immunity conferred by the African virus may protect only relatively poorly against the new American strains. This has implications for the possible spread of the American ZIKV strains to Africa and Southeast Asia, and also for the development of vaccines.

Dengue virus (DENV), an arthropod-borne ("arbovirus") virus causing a range of human maladies ranging from self-limiting dengue fever to the life-threatening dengue shock syndrome, proliferates well in two different taxa of the Animal Kingdom, mosquitoes and primates. Unexpectedly, mosquitoes and primates have distinct preferences when expressing their genes by translation, e.g. members of these taxa show taxonomic group-specific intolerance to certain codon pairs. This is called "codon pair bias". By necessity, arboviruses evolved to delicately balance this fundamental difference in their ORFs. Using the mosquito-borne human pathogen DENV we have undone the evolutionarily conserved genomic balance in its ORF sequence and specifically shifted the encoding preference away from primates. However, this recoding of DENV raised concerns of 'gain-of-function,' namely whether recoding could inadvertently increase fitness for replication in the arthropod vector. Using mosquito cell cultures and two strains of Aedes aegypti we did not observe any increase in fitness in DENV2 variants codon pair deoptimized for humans. This ability to disrupt and control an arbovirus's host preference has great promise towards developing the next generation of synthetic vaccines not only for DENV but for other emerging arboviral pathogens such as chikungunya virus and Zika virus.