In this work, we constructed a Collagen I-Matrigel composite extracellular matrix (ECM). The composite ECM was used to determine the influence of the local collagen fiber orientation on the collective intravasation ability of tumor cells. We found that the local fiber alignment enhanced cell-ECM interactions. Specifically, metastatic MDA-MB-231 breast cancer cells followed the local fiber alignment direction during the intravasation into rigid Matrigel (∼10 mg/mL protein concentration).

Abstract Factor-dependent termination uses molecular motors to remodel transcription machineries, but the associated mechanisms, especially in eukaryotes, are poorly understood. Here we use single-molecule fluorescence assays to characterize in real time the composition and the catalytic states of Saccharomyces cerevisiae transcription termination complexes remodeled by Sen1 helicase. We confirm that Sen1 takes the RNA transcript as its substrate and translocates along it by hydrolyzing multiple ATPs to form an intermediate with a stalled RNA polymerase II (Pol II) transcription elongation complex (TEC). We show that this intermediate dissociates upon hydrolysis of a single ATP leading to dissociation of Sen1 and RNA, after which Sen1 remains bound to the RNA. We find that Pol II ends up in a variety of states: dissociating from the DNA substrate, which is facilitated by transcription bubble rewinding, being retained to the DNA substrate, or diffusing along the DNA substrate. Our results provide a complete quantitative framework for understanding the mechanism of Sen1-dependent transcription termination in eukaryotes.

Abstract One of the primary challenges in current cancer immunotherapy is the insufficient infiltration of cytotoxic T cells into solid tumors. Despite ongoing investigations, the mechanisms restricting T cell infiltration in immune-cold tumors remains elusive, hindered by the intricate tumor microenvironment. Here, we co-cultured mouse cancer cell lines with cancer-specific cytotoxic T cells to study the influence of cancer-T cell interactions on T cell motility, a crucial factor for effective tumor infiltration. By quantifying T cell motility patterns, we found that cancer-specific T cells exhibited extended contact time with cancer-cell clusters and higher directional persistence than non-specific T cells. Computational modelling suggested that T cells with stronger persistence could facilitate efficient searching for cancer clusters. Transcriptomic profiling revealed T cells recognizing cancer cells orchestrate accumulation on cancer cell clusters by activating adhesion proteins on both cancer cells and T cells, thereby fostering prolonged interaction on cancer cells. Furthermore, we observed that there were two distinct subpopulations of cancer cells after co-culturing with cancer-specific T cells: one expressing elevated levels of T-cell attractants and antigen-presentation molecules, while the other expressing immunosuppressive molecules and undergoing epithelial-to-mesenchymal transition. These dynamic insights into the complex interplay of cancer-T cell interactions and their impact on T cell motility hold implications for refining more efficacious cancer immunotherapy strategies.

Abstract It is a big challenge to measure position changes of biomolecules in the direction normal to the plasma membranes of living cells. We developed a one donor-multiple quenchers Fӧrster resonance energy transfer method by using non-fluorescent quenchers in the extracellular environment. It senses subnanometer position changes of a fluorophore-labeled biomolecule in the plasma membrane. The method was validated by monitoring flip-flops of individual lipid molecules incorporated in plasma membranes. We studies membrane perforation by a host defense peptide from the extracellular side and found that the pore-forming peptide is dynamic, switching among different insertion depths. The method is especially useful in studying interactions of membrane proteins with the inner surfaces of plasma membranes. Our method will find wide applications in systematic analysis of fundamental cellular processes at plasma membranes.