A 22-kb DNA locus of Legionella pneumophila is described that contains 18 genes, 16 of which are required for macrophage killing ( icm genes). In this paper two previously described icm loci were linked by the discovery of five genes located between the two loci. Four of the newly described genes are required for macrophage killing ( icmMLKE ) and one is dispensable. The 16 icm genes appeared to be organized as six individual genes ( icmR , icmQ , icmG , icmC , icmD, and icmF ), and four operons ( icmTS , icmPO , icmMLKE , and icmJB ). Four icm genes ( icmP , icmO , icmL , and icmE ) show significant sequence similarity to plasmid genes involved in conjugation, whereas the other icm genes were found not to bear any sequence similarity to database entries. We found that L. pneumophila can mediate plasmid DNA transfer at a frequency of 10 −3 to 10 −4 per donor. Strains containing null mutations in two icm genes ( icmT and icmR ) showed a severe reduction in conjugation frequency and macrophage killing. Strains containing an insertion in four other icm genes ( icmF, icmE , icmC , and dotA ) were shown to have a less severe defect in conjugation. Mutations in the other 11 icm genes had no effect on conjugation frequency. We currently do not know whether conjugation itself plays a role in macrophage killing. It is possible either that small plasmids can take advantage of an existing secretion system to be mobilized or that DNA transfer is required for human macrophage killing by L. pneumophila .

We present the genomic sequence of Legionella pneumophila , the bacterial agent of Legionnaires' disease, a potentially fatal pneumonia acquired from aerosolized contaminated fresh water. The genome includes a 45–kilobase pair element that can exist in chromosomal and episomal forms, selective expansions of important gene families, genes for unexpected metabolic pathways, and previously unknown candidate virulence determinants. We highlight the genes that may account for Legionella 's ability to survive in protozoa, mammalian macrophages, and inhospitable environmental niches and that may define new therapeutic targets.

To study genome evolution in allopolyploid plants, we analyzed polyploid wheats and their diploid progenitors for the occurrence of 16 low-copy chromosome- or genome-specific sequences isolated from hexaploid wheat. Based on their occurrence in the diploid species, we classified the sequences into two groups: group I, found in only one of the three diploid progenitors of hexaploid wheat, and group II, found in all three diploid progenitors. The absence of group II sequences from one genome of tetraploid wheat and from two genomes of hexaploid wheat indicates their specific elimination from these genomes at the polyploid level. Analysis of a newly synthesized amphiploid, having a genomic constitution analogous to that of hexaploid wheat, revealed a pattern of sequence elimination similar to the one found in hexaploid wheat. Apparently, speciation through allopolyploidy is accompanied by a rapid, nonrandom elimination of specific, lowcopy, probably noncoding DNA sequences at the early stages of allopolyploidization, resulting in further divergence of homoeologous chromosomes (partially homologous chromosomes of different genomes carrying the same order of gene loci). We suggest that such genomic changes may provide the physical basis for the diploid-like meiotic behavior of polyploid wheat.

Gil Segal, Howard Shuman and colleagues sequence the genomes of 38 Legionella species and analyze 5,885 predicted effector proteins. Their analysis identifies a core set of seven effectors shared by all 38 species and numerous previously unidentified conserved effector domains. Infection by the human pathogen Legionella pneumophila relies on the translocation of ∼300 virulence proteins, termed effectors, which manipulate host cell processes. However, almost no information exists regarding effectors in other Legionella pathogens. Here we sequenced, assembled and characterized the genomes of 38 Legionella species and predicted their effector repertoires using a previously validated machine learning approach. This analysis identified 5,885 predicted effectors. The effector repertoires of different Legionella species were found to be largely non-overlapping, and only seven core effectors were shared by all species studied. Species-specific effectors had atypically low GC content, suggesting exogenous acquisition, possibly from the natural protozoan hosts of these species. Furthermore, we detected numerous new conserved effector domains and discovered new domain combinations, which allowed the inference of as yet undescribed effector functions. The effector collection and network of domain architectures described here can serve as a roadmap for future studies of effector function and evolution.

A large number of highly pathogenic bacteria utilize secretion systems to translocate effector proteins into host cells. Using these effectors, the bacteria subvert host cell processes during infection. Legionella pneumophila translocates effectors via the Icm/Dot type-IV secretion system and to date, approximately 100 effectors have been identified by various experimental and computational techniques. Effector identification is a critical first step towards the understanding of the pathogenesis system in L. pneumophila as well as in other bacterial pathogens. Here, we formulate the task of effector identification as a classification problem: each L. pneumophila open reading frame (ORF) was classified as either effector or not. We computationally defined a set of features that best distinguish effectors from non-effectors. These features cover a wide range of characteristics including taxonomical dispersion, regulatory data, genomic organization, similarity to eukaryotic proteomes and more. Machine learning algorithms utilizing these features were then applied to classify all the ORFs within the L. pneumophila genome. Using this approach we were able to predict and experimentally validate 40 new effectors, reaching a success rate of above 90%. Increasing the number of validated effectors to around 140, we were able to gain novel insights into their characteristics. Effectors were found to have low G+C content, supporting the hypothesis that a large number of effectors originate via horizontal gene transfer, probably from their protozoan host. In addition, effectors were found to cluster in specific genomic regions. Finally, we were able to provide a novel description of the C-terminal translocation signal required for effector translocation by the Icm/Dot secretion system. To conclude, we have discovered 40 novel L. pneumophila effectors, predicted over a hundred additional highly probable effectors, and shown the applicability of machine learning algorithms for the identification and characterization of bacterial pathogenesis determinants.

ABSTRACT Legionella pneumophila grows within membrane-bound vacuoles in phylogenetically diverse hosts. Intracellular growth requires the function of the Icm/Dot type-IVb secretion system, which translocates more than 300 proteins into host cells. A screen was performed to identify L. pneumophila proteins that stimulate mitogen-activated protein kinase (MAPK) activation, using Icm/Dot translocated proteins ectopically expressed in mammalian cells. In parallel, a second screen was performed to identify L. pneumophila proteins expressed in yeast that cause growth inhibition in MAPK pathway-stimulatory high-osmolarity medium. LegA7 was shared in both screens, a protein predicted to be a member of the bacterial cysteine protease family that has five carboxyl-terminal ankyrin repeats. Three conserved residues in the predicted catalytic triad of LegA7 were mutated. These mutations abolished the ability of LegA7 to inhibit yeast growth. To identify other residues important for LegA7 function, a generalizable selection strategy in yeast was devised to isolate mutants that have lost function and no longer cause growth inhibition on a high-osmolarity medium. Mutations were isolated in the two carboxyl-terminal ankyrin repeats, as well as an inter-domain region located between the cysteine protease domain and the ankyrin repeats. These mutations were predicted by AlphaFold modeling to localize to the face opposite from the catalytic site, arguing that they interfere with the positive regulation of the catalytic activity. Based on our data, we present a model in which LegA7 harbors a cysteine protease domain with an inter-domain and two carboxyl-terminal ankyrin repeat regions that modulate the function of the catalytic domain. IMPORTANCE Legionella pneumophila grows in a membrane-bound compartment in macrophages during disease. Construction of the compartment requires a dedicated secretion system that translocates virulence proteins into host cells. One of these proteins, LegA7, is shown to activate a stress response pathway in host cells called the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway. The effects on the mammalian MAPK pathway were reconstructed in yeast, allowing the development of a strategy to identify the role of individual domains of LegA7. A domain similar to cysteine proteases is demonstrated to be critical for impinging on the MAPK pathway, and the catalytic activity of this domain is required for targeting this path. In addition, a conserved series of repeats, called ankyrin repeats, controls this activity. Data are provided that argue the interaction of the ankyrin repeats with unknown targets probably results in activation of the cysteine protease domain.

ABSTRACT Legionella pneumophila grows within membrane-bound vacuoles in phylogenetically diverse hosts. Intracellular growth requires the function of the Icm/Dot type-IVb secretion system, which translocates more than 300 proteins into host cells. A screen was performed to identify L. pneumophila proteins that stimulate MAPK activation, using Icm/Dot translocated proteins ectopically expressed in mammalian cells. In parallel, a second screen was performed to identify L. pneumophila proteins expressed in yeast that cause growth inhibition in MAPK pathway-stimulatory high osmolarity medium. LegA7 was shared in both screens, a protein predicted to be a member of the bacterial cysteine protease family that has five carboxyl-terminal ankyrin repeats. Three conserved residues in the predicted catalytic triad of LegA7 were mutated. These mutations abolished the ability of LegA7 to inhibit yeast growth. To identify other residues important for LegA7 function, a generalizable selection strategy in yeast was devised to isolate mutants that have lost function and no longer cause growth inhibition on high osmolarity medium. Mutations were isolated in the two carboxyl-terminal ankyrin repeats, as well as an inter-domain region located between the cysteine protease domain and the ankyrin repeats. These mutations were predicted by AlphaFold modeling to localize to the face opposite from the catalytic site, arguing that they interfere with the positive regulation of the catalytic activity. Based on our data, we present a model in which LegA7 harbors a cysteine protease domain with an inter-domain and two carboxyl-terminal ankyrin repeat regions that modulate the function of the catalytic domain.