Transcription factor Nrf2 is essential for the antioxidant responsive element (ARE)-mediated induction of phase II detoxifying and oxidative stress enzyme genes. Detailed analysis of differential Nrf2 activity displayed in transfected cell lines ultimately led to the identification of a new protein, which we named Keap1, that suppresses Nrf2 transcriptional activity by specific binding to its evolutionarily conserved amino-terminal regulatory domain. The closest homolog of Keap1 is a Drosophila actin-binding protein called Kelch, implying that Keap1 might be a Nrf2 cytoplasmic effector. We then showed that electrophilic agents antagonize Keap1 inhibition of Nrf2 activity in vivo, allowing Nrf2 to traverse from the cytoplasm to the nucleus and potentiate the ARE response. We postulate that Keap1 and Nrf2 constitute a crucial cellular sensor for oxidative stress, and together mediate a key step in the signaling pathway that leads to transcriptional activation by this novel Nrf2 nuclear shuttling mechanism. The activation of Nrf2 leads in turn to the induction of phase II enzyme and antioxidative stress genes in response to electrophiles and reactive oxygen species.

Coordinate induction of phase 2 proteins and elevation of glutathione protect cells against the toxic and carcinogenic effects of electrophiles and oxidants. All inducers react covalently with thiols at rates that are closely related to their potencies. Inducers disrupt the cytoplasmic complex between the actin-bound protein Keap1 and the transcription factor Nrf2, thereby releasing Nrf2 to migrate to the nucleus where it activates the antioxidant response element (ARE) of phase 2 genes and accelerates their transcription. We cloned, overexpressed, and purified murine Keap1 and demonstrated on native gels the formation of complexes of Keap1 with the Neh2 domain of Nrf2 and their concentration-dependent disruption by inducers such as sulforaphane and bis(2-hydroxybenzylidene)acetone. The kinetics, stoichiometry, and order of reactivities of the most reactive of the 25 cysteine thiol groups of Keap1 have been determined by tritium incorporation from [(3)H]dexamethasone mesylate (an inducer and irreversible modifier of thiols) and by UV spectroscopy with sulforaphane, 2,2'-dipyridyl disulfide and 4,4'-dipyridyl disulfide (titrants of thiol groups), and two closely related Michael reaction acceptors [bis(2- and 4-hydroxybenzylidene)acetones] that differ 100-fold in inducer potency and the UV spectra of which are bleached by thiol addition. With large excesses of these reagents nearly all thiols of Keap1 react, but sequential reaction with three successive single equivalents (per cysteine residue) of dipyridyl disulfides revealed excellent agreement with pseudo-first order kinetics, rapid successive declines in reaction velocity, and the stoichiometric formation of two equivalents of thiopyridone per reacted cysteine. This finding suggests that reaction of cysteine thiols is followed by rapid formation of protein disulfide linkages. The most reactive residues of Keap1 (C(257), C(273), C(288), and C(297)) were identified by mapping the dexamethasone-modified cysteines by mass spectrometry of tryptic peptides. These residues are located in the intervening region between BTB and Kelch repeat domains of Keap1 and probably are the direct sensors of inducers of the phase 2 system.

Electrophiles and reactive oxygen species have been implicated in the pathogenesis of many diseases. Transcription factor Nrf2 was recently identified as a general regulator of one defense mechanism against such havoc. Nrf2 regulates the inducible expression of a group of detoxication enzymes, such as glutathione S-transferase and NAD(P)H:quinone oxidoreductase, via antioxidant response elements. Using peritoneal macrophages from Nrf2-deficient mice, we show here that Nrf2 also controls the expression of a group of electrophile- and oxidative stress-inducible proteins and activities, which includes heme oxygenase-1, A170, peroxiredoxin MSP23, and cystine membrane transport (system xc−) activity. The response to electrophilic and reactive oxygen species-producing agents was profoundly impaired in Nrf2-deficient cells. The lack of induction of system xc− activity resulted in the minimum level of intracellular glutathione, and Nrf2-deficient cells were more sensitive to toxic electrophiles. Several stress agents induced the DNA binding activity of Nrf2 in the nucleus without increasing its mRNA level. Thus Nrf2 regulates a wide-ranging metabolic response to oxidative stress. Electrophiles and reactive oxygen species have been implicated in the pathogenesis of many diseases. Transcription factor Nrf2 was recently identified as a general regulator of one defense mechanism against such havoc. Nrf2 regulates the inducible expression of a group of detoxication enzymes, such as glutathione S-transferase and NAD(P)H:quinone oxidoreductase, via antioxidant response elements. Using peritoneal macrophages from Nrf2-deficient mice, we show here that Nrf2 also controls the expression of a group of electrophile- and oxidative stress-inducible proteins and activities, which includes heme oxygenase-1, A170, peroxiredoxin MSP23, and cystine membrane transport (system xc−) activity. The response to electrophilic and reactive oxygen species-producing agents was profoundly impaired in Nrf2-deficient cells. The lack of induction of system xc− activity resulted in the minimum level of intracellular glutathione, and Nrf2-deficient cells were more sensitive to toxic electrophiles. Several stress agents induced the DNA binding activity of Nrf2 in the nucleus without increasing its mRNA level. Thus Nrf2 regulates a wide-ranging metabolic response to oxidative stress. reactive oxygen species glutathione S-transferase NAD(P)H:quinone oxidoreductase electrophile-responsive element antioxidant-responsive element heme oxygenase-1 diethylmaleate 3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide 1-chloro-2,4-dinitrobenzene t-butylhydroquinone lipopolysaccharide electrophoretic mobility shift assay Maf recognition element stress-responsive element Oxidative stress conditions or enhanced production of reactive oxygen species (ROS)1 result from a variety of stimuli including ionizing radiation, exposure to xenobiotics, inflammation, and phagocytosis (1.Sies H. Am. J. Med. 1991; 91: 31-38Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (661) Google Scholar). Treatment of mammalian cells with electrophilic agents usually provokes cellular responses, including transcriptional activation of genes encoding proteins that partake in the defense against oxidative stress. This process is referred to as the electrophile counterattack response (2.Prestera T. Zhang Y. Spencer S.R. Wilczak C.A. Talalay P. Adv. Enzyme. Regul. 1993; 33: 281-296Crossref PubMed Scopus (257) Google Scholar). Through analyses of mouse and rat glutathione S-transferase (GST) Ya subunit genes and the rat NAD(P)H:quinone oxidoreductase (NQO1) subunit gene, the cis-acting element responsible for the induction by electrophiles was independently identified as an electrophile-responsive element (EpRE) (3.Friling R.S. Bensimon A. Tichauer Y. Daniel V. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1990; 87: 6258-6262Crossref PubMed Scopus (429) Google Scholar) or antioxidant-responsive element (ARE) (4.Rushmore T.H. Morton M.R. Pickett C.B. J. Biol. Chem. 1991; 266: 11632-11639Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). The consensus ARE sequence has been extensively characterized (5.Wasserman W.W. Fahl W.E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 5361-5366Crossref PubMed Scopus (636) Google Scholar). The consensus binding sequence of erythroid transcription factor NF-E2 shows high similarity to the ARE/EpRE sequence. Also, the expression profile of Nrf2, one of the NF-E2 subunit factors, overlaps with those of drug-metabolizing enzymes such as GST and NQO1. Based on these facts, we recently demonstrated that transcription factor Nrf2 (6.Moi P. Chan K. Asunis I. Cao A. Kan W.Y. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 9926-9930Crossref PubMed Scopus (1252) Google Scholar, 7.Itoh K. Igarashi K. Hayashi N. Nishizawa M. Yamamoto M. Mol. Cell. Biol. 1995; 15: 4184-4193Crossref PubMed Scopus (365) Google Scholar, 8.Chui D.H.K. Tang W. Orkin S.H. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995; 209: 40-46Crossref PubMed Scopus (61) Google Scholar) is essential for the coordinated transcriptional activation of genes encoding the drug-metabolizing enzymes, such as GST and NQO1, via AREs/EpREs (9.Itoh K. Chiba T. Takahashi S. Ishii T. Igarashi K. Katoh Y. Oyake T. Hayashi N. Satoh K. Hatayama I. Yamamoto M. Nabeshima Y. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997; 236: 313-322Crossref PubMed Scopus (3226) Google Scholar). Nrf2-deficient mice fed with butylated hydroxyanisole, which normally leads to a pronounced up-regulation of Alpha, Pi, and Mu classes of GSTs and NQO1, failed to induce either of these detoxication enzymes in the liver or intestine (9.Itoh K. Chiba T. Takahashi S. Ishii T. Igarashi K. Katoh Y. Oyake T. Hayashi N. Satoh K. Hatayama I. Yamamoto M. Nabeshima Y. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997; 236: 313-322Crossref PubMed Scopus (3226) Google Scholar). Since these detoxication enzymes decrease the level of oxidative stress by removing compounds capable of generating ROS or other highly reactive substances, they thereby constitute part of the defense mechanism against oxidative stress (10.Prestera T. Talalay P. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995; 92: 8965-8969Crossref PubMed Scopus (219) Google Scholar). Because ARE-type cis-acting sequences are frequently found in the regulatory regions of a number of other oxidative stress-inducible genes (5.Wasserman W.W. Fahl W.E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 5361-5366Crossref PubMed Scopus (636) Google Scholar, 11.Inamdar N.M. Ahn Y.I. Alam J. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996; 221: 570-576Crossref PubMed Scopus (177) Google Scholar, 12.Prestera T. Talalay P. Alam J. Ahn Y. Lee P.J. Choi A.M.K. Mol. Med. 1995; 1: 827-837Crossref PubMed Google Scholar, 13.Dalton T. Palmiter R.D. Andrews G.K. Nucleic Acids Res. 1994; 22: 5016-5023Crossref PubMed Scopus (251) Google Scholar), we hypothesized that Nrf2 might also serve as the key transcription factor activating these genes. A number of defense proteins and activities in murine peritoneal macrophages are markedly induced upon exposure to electrophilic agents or other oxidative stresses. These proteins include heme oxygenase-1 (HO-1) (14.Keyse S.M. Tyrrell R.M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1989; 86: 99-103Crossref PubMed Scopus (1118) Google Scholar, 15.Poss K.D. Tonegawa S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 10925-10930Crossref PubMed Scopus (1119) Google Scholar, 16.Taketani S. Sato H. Yoshinaga T. Tokunaga R. Ishii T. Bannai S. J. Biochem. (Tokyo). 1990; 108: 28-32Crossref PubMed Scopus (47) Google Scholar), peroxiredoxin MSP23 (17.Ishii T. Yamada M. Sato H. Matsue M. Taketani S. Nakayama K. Sugita Y. Bannai S. J. Biol. Chem. 1993; 268: 18633-18636Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar), the cystine membrane transporter (system xc−) (18.Bannai S. Tateishi N. J. Membr. Biol. 1986; 89: 1-8Crossref PubMed Scopus (305) Google Scholar) and 60-kDa stress protein A170 (19.Ishii T. Yanagawa T. Kawane T. Yuki K. Seita J. Yoshida H. Bannai S. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996; 226: 456-460Crossref PubMed Scopus (79) Google Scholar). HO-1 is prominently induced under various oxidative stress conditions in many different cell types (14.Keyse S.M. Tyrrell R.M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1989; 86: 99-103Crossref PubMed Scopus (1118) Google Scholar). HO-1-deficient embryonic fibroblasts are hypersensitive to the cytotoxicity of both hemin and hydrogen peroxide (15.Poss K.D. Tonegawa S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 10925-10930Crossref PubMed Scopus (1119) Google Scholar). Induction of system xc− activity increases the intracellular cysteine pool, which consequently augments the synthesis of GSH (20.Bannai S. Sato H. Ishii T. Taketani S. Biochim. Biophys. Acta. 1991; 1092: 175-179Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar), a potent antioxidant with a short half-life. MSP23 is the murine peroxiredoxin I with antioxidative activity (21.Ishii T. Kawane T. Taketani S. Bannai S. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995; 216: 970-975Crossref PubMed Scopus (44) Google Scholar). It was recently shown that a mammalian peroxiredoxin isoform reduces the intracellular hydrogen peroxide level utilizing thioredoxin as an immediate electron donor (22.Kang S.W. Chae H.Z. Seo M.S. Kim K. Baines I.C. Rhee S.G. J. Biol. Chem. 1998; 273: 6297-6302Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (621) Google Scholar) and protects cells from apoptosis by oxidative stress (23.Zhang P. Liu B. Kang S.W. Seo M.S. Rhee S.G. Obeid L.M. J. Biol. Chem. 1997; 272: 30615-30618Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (336) Google Scholar). A170 has a structural domain that interacts with ubiquitin (24.Vadlamudi R.K. Joung I. Strominger J.L. Shin J. J. Biol. Chem. 1996; 271: 20235-20237Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (260) Google Scholar) and PKC-ζ (25.Puls A. Schmidt S. Grawe F. Stabel S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 6191-6196Crossref PubMed Scopus (194) Google Scholar). Electrophilic agents, such as diethylmaleate (DEM), and other oxidative stress agents have been reported to induce the proteins HO-1, A170, MSP23, and system xc− activity in peritoneal macrophages (20.Bannai S. Sato H. Ishii T. Taketani S. Biochim. Biophys. Acta. 1991; 1092: 175-179Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar) and fibroblasts (26.Bannai S. J. Biol. Chem. 1984; 259: 2435-2440Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). To determine whether these antioxidant stress proteins are also under the regulation of Nrf2, we examined in this study the electrophilic induction of this group of genes in peritoneal macrophages from the nrf2-null mutant mouse. Female wild type ICR andnrf2 mutant mice (9.Itoh K. Chiba T. Takahashi S. Ishii T. Igarashi K. Katoh Y. Oyake T. Hayashi N. Satoh K. Hatayama I. Yamamoto M. Nabeshima Y. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997; 236: 313-322Crossref PubMed Scopus (3226) Google Scholar) weighing 20–25 g received an intraperitoneal injection of 2 ml of 4% thioglycollate broth. Four days later, macrophages were collected by peritoneal lavage (17.Ishii T. Yamada M. Sato H. Matsue M. Taketani S. Nakayama K. Sugita Y. Bannai S. J. Biol. Chem. 1993; 268: 18633-18636Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). The cells were resuspended at 7.5 × 105 cells/ml and cultured in RPMI 1640 medium containing 10% (v/v) fetal bovine serum as described previously (17.Ishii T. Yamada M. Sato H. Matsue M. Taketani S. Nakayama K. Sugita Y. Bannai S. J. Biol. Chem. 1993; 268: 18633-18636Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). For the 3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) (27.Carmichael J. DeGraff W.G. Gazdar A.F. Minna J.D. Mitchell J.B. Cancer Res. 1987; 15: 936-942Google Scholar) assay, the cells were resuspended at 2 × 105 cells/ml and cultured in medium without fetal bovine serum. After 1 h of culture, stress agents were added to the medium. Final concentrations of the agents in the medium were 100 μm for DEM, paraquat, and hydrogen peroxide (H2O2); 80 μm for catechol; 20 milliunits/ml for glucose oxidase (GO); 5 μm for CdCl2 and menadione (2-methyl-1,4-naphthoquinone); 10 μm for 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB); 20 μm for iodoacetic acid; 2.5 μm for t-butylhydroquinone (t-BHQ) and sodium arsenite (NaAsO2); and 1 ng/ml for lipopolysaccharide (LPS). The macrophages were harvested at the times indicated in the figure legends. Cell viability was measured by the MTT assay (27.Carmichael J. DeGraff W.G. Gazdar A.F. Minna J.D. Mitchell J.B. Cancer Res. 1987; 15: 936-942Google Scholar) and the trypan blue dye exclusion test. Total cellular RNA was extracted from macrophages by RNAzolTM B (TEL-TEST, Inc., Friendswood, TX). The RNA samples (10 μg) were electrophoresed and transferred to Zeta-Probe GT membranes (Bio-Rad). The membranes were probed with 32P-labeled cDNA probes as indicated in the figure legends. β-Actin cDNA was used as a positive control. Macrophages were solubilized with SDS-sample buffer (without dye or 2-mercaptoethanol), and protein concentrations were estimated by the BCA protein assay (Pierce). The proteins were separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of 2-mercaptoethanol and electrotransferred onto Immobilon membrane (Millipore Corp., Bedford, MA). To detect immunoreactive proteins, we used horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG and ECL blotting reagents (Amersham Pharmacia Biotech). Polyclonal rabbit antisera raised against rat HO-1, rat MSP23, and recombinant murine A170 were used as described previously (19.Ishii T. Yanagawa T. Kawane T. Yuki K. Seita J. Yoshida H. Bannai S. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996; 226: 456-460Crossref PubMed Scopus (79) Google Scholar, 21.Ishii T. Kawane T. Taketani S. Bannai S. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995; 216: 970-975Crossref PubMed Scopus (44) Google Scholar). Specific antibody was raised against Nrf2 by immunizing rabbits with recombinant Nrf2 protein (amino acids 140–318 fused with E. colimaltose-binding protein). An anti-actin antiserum was purchased from Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Densitometric analysis was performed using NIH Image software. Cystine transport activity was measured using 14C-labeled cystine in phosphate-buffered saline containing 0.1% glucose as described previously (20.Bannai S. Sato H. Ishii T. Taketani S. Biochim. Biophys. Acta. 1991; 1092: 175-179Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar). Total (i.e. reduced plus oxidized) GSH was extracted from macrophages with 5% trichloroacetic acid solution, and GSH content was measured as described previously (20.Bannai S. Sato H. Ishii T. Taketani S. Biochim. Biophys. Acta. 1991; 1092: 175-179Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar). The quail fibroblast cell line QT6 (28.Moscovici C. Moscovici M.G. Jimenez H. Lai M.M. Hayman M.J. Vogt P.K. Cell. 1977; 11: 95-103Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (280) Google Scholar) was maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% fetal bovine serum and seeded in 24-well dishes 24 h before transfection. The cells were transfected with reporter (pHO-1-Luc (see “Results”) and pRBGP2 (7.Itoh K. Igarashi K. Hayashi N. Nishizawa M. Yamamoto M. Mol. Cell. Biol. 1995; 15: 4184-4193Crossref PubMed Scopus (365) Google Scholar)) plasmids and an effector plasmid (cNrf2; Ref. 7.Itoh K. Igarashi K. Hayashi N. Nishizawa M. Yamamoto M. Mol. Cell. Biol. 1995; 15: 4184-4193Crossref PubMed Scopus (365) Google Scholar) using calcium phosphate precipitation as described previously (29.Sambrook J. Fritsch E.F. Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY1989Google Scholar). The Luciferase assay was performed by utilizing the Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI) following the supplier's protocol and measured in a Biolumat Luminometer (Berthold, Germany). Transfection efficiencies were routinely normalized to the activity of a co-transfected β-galactosidase expression plasmid, pENL. Normally, three independent experiments, each carried out in duplicate, were performed, and the results were averaged. The cells were washed 12 h after transfection, and then DEM (Wako, Tokyo) was immediately added to the culture medium. Nuclear extracts were prepared from macrophages as described previously (7.Itoh K. Igarashi K. Hayashi N. Nishizawa M. Yamamoto M. Mol. Cell. Biol. 1995; 15: 4184-4193Crossref PubMed Scopus (365) Google Scholar). An oligonucleotide containing the stress-responsive element of theho-1 AB1 enhancer (5′-TCTGTTTTCGCTGAGTCATGGTTCCCGTTG-3′) was labeled with [γ-32P]ATP by T4 polynucleotide kinase. EMSA was performed as described previously (7.Itoh K. Igarashi K. Hayashi N. Nishizawa M. Yamamoto M. Mol. Cell. Biol. 1995; 15: 4184-4193Crossref PubMed Scopus (365) Google Scholar). Where indicated, antibodies were included in the binding reaction at 1:10 to 1:100 dilutions. The anti-chicken MafK antibody was described previously (9.Itoh K. Chiba T. Takahashi S. Ishii T. Igarashi K. Katoh Y. Oyake T. Hayashi N. Satoh K. Hatayama I. Yamamoto M. Nabeshima Y. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997; 236: 313-322Crossref PubMed Scopus (3226) Google Scholar), and that against human Nrf2 was purchased from Santa Cruz Biotechnology. In competition experiments, a 100-fold excess of unlabeled double-stranded oligonucleotides was included in the reaction (7.Itoh K. Igarashi K. Hayashi N. Nishizawa M. Yamamoto M. Mol. Cell. Biol. 1995; 15: 4184-4193Crossref PubMed Scopus (365) Google Scholar). A number of proteins or activities are induced by electrophilic agents in murine peritoneal macrophages. To test whether the electrophilic induction of this group of genes shares a common regulatory mechanism with that of the drug-metabolizing enzymes, we examined their expression in Nrf2-deficient macrophages. Peritoneal macrophages were harvested from nrf2-homozygous and -heterozygous mutant (or wild type) female ICR siblings. The macrophages were then independently challenged with DEM (an electrophilic agent), paraquat (an O⨪2 generator), GO (an H2O2generator), or CdCl2 (heavy metal). After challenging macrophages with these agents, we examined expression levels of three oxidative stress-inducible proteins (below) by immunoblotting and RNA blotting analyses. Since wild type and heterozygous mutant mice did not show large differences in induction of the antioxidative proteins, we used both types of macrophages as positive controls. We first measured the levels of HO-1, MSP23, and A170 proteins 1 h after the start of in vitro culture and found that the basal levels of these proteins in the heterozygous macrophages were similar to those of nrf2-homozygous mutant macrophages (Fig.1 A, lanes 1 and 7). After transfer of thenrf2-heterozygous cells to in vitroculture, these stress-inducible proteins were gradually induced by unknown mechanisms (compare lanes 1 and2). The gradual induction of HO-1 and MSP23 expression was not seen in Nrf2-deficient cells (lanes 2and 8). The important finding here was that whereas all of the stress agents tested induced HO-1, MSP23, and A170 innrf2-heterozygous cells, induction was largely canceled in Nrf2-deficient cells. Closer examination revealed that in nrf2-null mutant cells (lanes 9–12) induction of HO-1 and A170 by DEM and GO was severely affected, but induction by paraquat and CdCl2 was less impaired. In contrast, while MSP23 was markedly induced by these agents in nrf2-heterozygous cells, induction was largely absent in nrf2-null mutant cells. We also examined induction of these proteins by other stress agents: catechol, CDNB, H2O2, iodoacetic acid, sodium arsenite, menadione, and t-BHQ. Quantitative analysis by densitometry of the stained bands is shown in Table I. Menadione and catechol induced HO-1 in the Nrf2-deficient cells at levels comparable with those in nrf2-heterozygous mutant cells, suggesting the involvement of signal-transducing pathway(s) other than the Nrf2 system. Apparently, induction of HO-1 by sodium arsenite, t-BHQ, CDNB, and iodoacetic acid is largely, if not exclusively, dependent on the presence of Nrf2. A significant increase of MSP23 by all stress agents except sodium arsenite, H2O2, and iodoacetic acid was also observed in the heterozygous mutant cells but not in homozygous mutant cells (Table I). These results thus indicate that inducible expression of MSP23 is regulated mainly through the ARE/Nrf2 system.Table IQuantitative analysis of the induction of HO-1 and MSP23 proteins by various stress agentsAgentsHO-1MSP23Nrf2 (+/−)Nrf2 (−/−)Nrf2 (+/−)Nrf2 (−/−)relative absorbanceNone (1 h)0.58 ± 0.020.50 ± 0.190.60 ± 0.170.50 ± 0.25None (9 h)1.000.57 ± 0.121.000.50 ± 0.16DEM1.67 ± 0.170.69 ± 0.041.83 ± 0.040.54 ± 0.30CDNB2.94 ± 0.210.77 ± 0.021.51 ± 0.690.34 ± 0.08GO1.22 ± 0.020.57 ± 0.071.51 ± 0.020.34 ± 0.21H2O21.26 ± 0.100.55 ± 0.060.97 ± 0.270.38 ± 0.14t-BHQ1.91 ± 0.770.86 ± 0.471.58 ± 0.070.44 ± 0.27Menadione6.38 ± 3.934.54 ± 2.761.94 ± 0.100.58 ± 0.21Catechol3.70 ± 0.021.77 ± 0.061.75 ± 0.060.52 ± 0.17CdCl21.57 ± 0.141.21 ± 0.081.38 ± 0.220.35 ± 0.15Paraquat1.34 ± 0.030.88 ± 0.031.50 ± 0.280.55 ± 0.25NaAsO23.70 ± 1.301.08 ± 0.511.01 ± 0.110.43 ± 0.16Iodoacetic acid2.05 ± 0.100.98 ± 0.271.15 ± 0.170.60 ± 0.27The protein levels were calculated from densitometrical analysis of the immunoblot bands. Results are mean ± S.D. of 3–5 separate experiments. The standard levels (1.00) are those of cells cultured for 9 h without agents. The culture conditions are the same as in Fig. 1 A. Open table in a new tab The protein levels were calculated from densitometrical analysis of the immunoblot bands. Results are mean ± S.D. of 3–5 separate experiments. The standard levels (1.00) are those of cells cultured for 9 h without agents. The culture conditions are the same as in Fig. 1 A. To assess the induction process at the level of transcription, RNA was extracted from macrophages that had been treated with various stress agents and analyzed by the RNA blot analysis. Treatment with stress agents significantly increased the levels of HO-1 and MSP23 mRNA innrf2-heterozygous cells (Fig. 1 B,lanes 1–6), but the induction was markedly impaired in nrf2-null mutant cells (lanes 7–12). In contrast, whereas the lack of the induction of A170 mRNA in nrf2-null mutant cells was evident when DEM was used as the stress agent, the induction was only partially affected in Nrf2-deficient cells when paraquat, GO, or CdCl2 was used as an inducer. Marked induction of the genes was also observed in the nrf2-heterozygous cells treated with menadione, t-BHQ, catechol, or CDNB (data not shown). The induction of HO-1 mRNA by menadione and catechol was diminished in Nrf2-null mutant cells, while that byt-BHQ and CDNB was largely abolished. Induction of MSP23 mRNA by all of these agents was markedly impaired innrf2-null mutant cells. The three oxidative stress-inducible genes we addressed here showed roughly comparable variation in the mRNA and protein levels in response to various stress agents (Fig. 1, compare A and B, and data not shown). These results thus indicate that Nrf2 regulates the stress agent-mediated induction of HO-1, MSP23, and A170 gene expression. The results also clearly show that the contribution of Nrf2 to the transcriptional activation of these genes differed based upon the stress-inducing agent. Because oxidative stress agents transcriptionally induce system xc−activity in macrophages (20.Bannai S. Sato H. Ishii T. Taketani S. Biochim. Biophys. Acta. 1991; 1092: 175-179Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar, 26.Bannai S. J. Biol. Chem. 1984; 259: 2435-2440Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar), the stress induction of system xc− activity innrf2-null mutant cells was examined next (Fig.2 A). Whereasnrf2-heterozygous cells show system xc− activity comparable with that of wild type cells under both basal and induced conditions (data not shown), the oxidative stress agents DEM, paraquat, GO, and CdCl2 barely induced system xc− activity innrf2-null mutant cells (Fig. 2 A). In contrast, LPS, a well known inducer of system xc− activity (30.Sato H. Fujiwara K. Sagara J. Bannai S. Biochem. J. 1995; 310: 547-551Crossref PubMed Scopus (101) Google Scholar), significantly induced the system xc− activity even innrf2-null mutant cells, indicating that LPS induction is mediated through an alternative regulatory pathway rather than the Nrf2 pathway. These results argue that the transcription of the cystine transporter gene may be under the regulatory influence of Nrf2. It should be noted that system xc−activity is necessary to maintain a high GSH level in cultured macrophages, since cysteine is easily oxidized to cystine upon exposure to air (18.Bannai S. Tateishi N. J. Membr. Biol. 1986; 89: 1-8Crossref PubMed Scopus (305) Google Scholar). While the addition of 500 μm to 1 mm of DEM to the culture medium depletes the intracellular stores of GSH significantly, the addition of 100 μm DEM only diminishes the GSH level minimally, and then its level increases as a result of induced system xc−activity (26.Bannai S. J. Biol. Chem. 1984; 259: 2435-2440Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). As expected, the defect in inducible expression of system xc− activity innrf2-null mutant cells resulted in a decrease in cellular GSH content; after a 24-h incubation with DEM, the GSH level dropped to less than half its original level (Fig. 2 B). The AB1 and SX2 enhancers of theho-1 gene (31.Alam J. J. Biol. Chem. 1994; 269: 25049-25056Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar) contain three and two copies, respectively, of the Maf recognition element (MARE), which largely overlaps with ARE (32.Motohashi H. Shavit J.A. Igarashi K. Yamamoto M. Engel J.D. Nucleic Acids Res. 1997; 25: 2953-2959Crossref PubMed Scopus (238) Google Scholar). Due to their responsiveness to a wide variety of stress agents including oxidative stress, the MAREs were also named stress-responsive elements (StREs) (31.Alam J. J. Biol. Chem. 1994; 269: 25049-25056Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 32.Motohashi H. Shavit J.A. Igarashi K. Yamamoto M. Engel J.D. Nucleic Acids Res. 1997; 25: 2953-2959Crossref PubMed Scopus (238) Google Scholar, 33.Alam J. Camhi S. Choi A.M.K. J. Biol. Chem. 1995; 270: 11977-11984Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (195) Google Scholar, 34.Choi A.M.K. Alam J. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1996; 15: 9-19Crossref PubMed Scopus (1020) Google Scholar). To ask whether Nrf2 can regulate the expression of this antioxidative stress gene via the ho-1AB1 enhancer, we co-transfected a Nrf2 expression plasmid and aho-1 AB1 enhancer-luciferase (pHO-1-Luc) reporter or β-globin enhancer-luciferase (pRBGP2) reporter into QT6 fibroblasts (Fig. 3 A). DEM (Fig.3 B) and Nrf2 overexpression (Fig. 3 C) both activated HO-1-Luc reporter gene expression, with the highest concentrations of these agents generating more than 10-fold activation. This increase was strictly dependent on the presence of the AB1 enhancer (data not shown). We also tested a pRBGP2 reporter that contains three tandem copies of the NF-E2 binding sequence of the chicken β-globin enhancer (7.Itoh K. Igarashi K. Hayashi N. Nishizawa M. Yamamoto M. Mol. Cell. Biol. 1995; 15: 4184-4193Crossref PubMed Scopus (365) Google Scholar), a sequence that is very similar to the AB1 enhancer sequence. Interestingly, the pRBGP2 reporter responded more efficiently than the pHO-1-Luc reporter did to both DEM and the overexpression of Nrf2 (Fig. 3, B and C). These results indicate that StREs in the AB1 enhancer are actually responsible for the activation of ho-1 gene expression and that Nrf2 can activate the ho-1 gene expression through StREs. Given the clear lack of inductive response in a number of electrophile-inducible genes, it was of interest to determine how oxidative stress agents activate Nrf2 and thereby induce a group of genes to counteract oxidative stress. To this end, we first examined the level of Nrf2 mRNA in macrophages under various oxidative stresses and found that the mRNA level was not changed significantly by any of the oxidative stress agents tested (Fig.4 A). In contrast, we found that these same stress agents significantly enhanced the DNA binding activity of Nrf2 to the StRE of HO-1 AB1 enhancer. StRE binding activity in nuclear extracts was strongly induced by DEM treatment of macrophages, as revealed by the retarded band (arrow in Fig. 4 B, lanes 1and 2). The induction of binding activity was not observed in nuclear extracts prepared from nrf2-deficient cells (Fig. 4 B, lanes 3 and4). The complex was effectively competed by the addition of an excess of unlabeled StRE, mouse GST Ya gene ARE, or chicken β-globin enhancer NF-E2 binding site but not by a yeast Gal4 binding consensus sequence (Fig. 4 D). This DNA-protein complex was markedly diminished by treatment with antibodies against mouse Nrf2 (Fig. 4 C, lane 3) and chicken MafK (lane 4), which are partner molecules together comprising the heterodimeric transcription factor complex (34.Choi A.M.K. Alam J. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1996; 15: 9-19Crossref PubMed Scopus (1020) Google Scholar), but the decrease was not obvious using a normal rabbit IgG (lane 5). These results indicate that the DNA-protein complex contains both Nrf2 and small Maf proteins. The same binding activity was also induced in nuclear extracts of macrophages treated with GO, paraquat, or CdCl2 (Fig.4 E). The Nrf2 expression level was also examined by immunoblotting analyses of nuclear extracts prepared from the macrophages treated with these stress agents. We found that DEM, GO, paraquat, CdCl2, and CDNB all increased the Nrf2 level 1.5–3-fold (Fig. 4 F). We therefore concluded that post-transcriptional regulation might be involved in the activation of Nrf2 by electrophilic agents and ROS. The analysis thus f

Abstract Background: Transcription factor Nrf2 regulates the expression of a set of detoxifying and anti‐oxidant enzyme genes. Several lines of evidence suggest that electrophiles and reactive oxygen species liberate Nrf2 from its cytoplasmic repressor Keap1 and provoke the accumulation of Nrf2 in the nucleus. To elucidate the molecular mechanisms as to how Nrf2 is activated by inducers, we examined the cytoplasmic‐nuclear shuttling and turnover of Nrf2. Results: We found that Nrf2 is rapidly degraded through the proteasome pathway, while electrophiles cause Nrf2 nuclear translocation with concomitant stabilization. Crucial to the inducible accumulation of Nrf2 is the enfeebling of the Nrf2–Keap1 interaction by electrophiles. Exploiting mice which have the LacZ reporter gene knocked into the nrf2 locus, we revealed that the inducible accumulation of Nrf2 protein by electrophiles in macrophages and intestinal epithelia could be recapitulated by the Nrf2 N‐terminal region in combination with a nuclear localization signal. We also found constitutive Nrf2 nuclear accumulation in Keap1‐deficient mouse macrophages. Conclusions: Our results highlight the fact that Nrf2 protein turnover is regulated by Keap1 mediated subcellular compartmentalization.

The expression of the phase 2 detoxification enzymes and antioxidant proteins is induced at the transcriptional level by Nrf2 and negatively regulated at the posttranslational level by Keap1 through protein-protein interactions with and subsequent proteolysis of Nrf2. We found that the Neh2 domain of Nrf2 is an intrinsically disordered but biologically active regulatory domain containing a 33-residue central α-helix followed by a mini antiparallel β-sheet. Isothermal calorimetry analysis indicated that one Neh2 molecule interacts with two molecules of Keap1 via two binding sites, the stronger binding ETGE motif and the weaker binding DLG motif. Nuclear magnetic resonance titration study showed that these two motifs of the Neh2 domain bind to an overlapping site on the bottom surface of the β-propeller structure of Keap1. In contrast, the central α-helix of the Neh2 domain does not have any observable affinity to Keap1, suggesting that this region may serve as a bridge connecting the two motifs for the association with the two β-propeller structures of a dimer of Keap1. Based on these observations, we propose that Keap1 recruits Nrf2 by the ETGE motif and that the DLG motif of the Neh2 domain locks its lysine-rich central α-helix in a correct position to benefit ubiquitin signaling.

Background Nrf2 belongs to the Cap‐N‐Collar (CNC) transcription factor family and is essential for the antioxidant responsive element (ARE)‐mediated expression of a group of detoxifying and antioxidant genes. The forced expression of Nrf2 in mammalian cells activates the expression of target genes through the ARE, with Nrf2 showing the highest transactivation activity among the CNC family of transcription factors. To elucidate the molecular mechanisms generating this potent transactivation activity, we examined the functions of the domains within Nrf2. Result We found that Nrf2 contains two transcription activation domains, Neh4 and Neh5, which act synergistically to attain maximum a activation of reporter gene expression. Neh4 and Neh5 both individually and cooperatively bind to CBP ( C REB ( c AMP R esponsive E lement B inding protein) B inding P rotein). In fact, the specific inhibitor of CBP, adenovirus E1A protein, significantly reduced Nrf2 activity. Importantly, the CBP‐binding activity of Nrf2 deletion mutants positively correlated with their transactivation activity. Neh5 contains a motif which is commonly conserved among the CNC factors, whereas Neh4 contains the novel CBP‐interacting motif recently identified in p53 and E2F. Conclusions Our results indicate that Nrf2 exploits the cooperative binding of two independent transactivation domains to CBP in the acquisition of a potent transactivation activity.

Rab11 is known to associate primarily with perinuclear recycling endosomes and regulate recycling of endocytosed proteins. However, the recycling step in which Rab11 participates remains unknown. We here show that, in addition to causing tubulation of recycling endosomes, Rab11 depletion gives rise to accumulation of recycling carriers containing endocytosed transferrin and transferrin receptor beneath the plasma membrane. We also show that the carriers are transported from perinuclear recycling endosomes to the cell periphery along microtubules. Total internal reflection fluorescence microscopy of cells expressing EGFP-tagged transferrin receptor revealed that Rab11 depletion inhibits tethering and fusion of recycling carriers to the plasma membrane. Depletion of a component of the exocyst tethering complex, Sec15 or Exo70, the former which interacts with Rab11, leads to essentially the same phenotypes as those of Rab11 depletion. Thus, in addition to its role in recycling processes at perinuclear recycling endosomes, Rab11 is transported along microtubules to the cell periphery through association with recycling carriers, and directly regulates vesicle exocytosis at the plasma membrane in concert with the exocyst.

Hedgehog (Hh) signaling, an evolutionarily conserved pathway, plays an essential role in development and tumorigenesis, making it a promising drug target. Multiple negative regulators are known to govern Hh signaling; however, how activated Smoothened (SMO) participates in the activation of downstream GLI2 and GLI3 remains unclear. Herein, we identified the ciliary kinase DYRK2 as a positive regulator of the GLI2 and GLI3 transcription factors for Hh signaling. Transcriptome and interactome analyses demonstrated that DYRK2 phosphorylates GLI2 and GLI3 on evolutionarily conserved serine residues at the ciliary base, in response to activation of the Hh pathway. This phosphorylation induces the dissociation of GLI2/GLI3 from suppressor, SUFU, and their translocation into the nucleus. Loss of

Abstract Introduction SNPs associated with genome-wide risk for multiple sclerosis (MS) modulate expression of ankyrin repeat domain protein 55 (ANKRD55). The function of ANKRD55 is not well understood. A role for ANKRD55 in ciliar transport in multiciliated cells has been reported. To gain deeper insight in how ANKRD55 may modulate neuro-inflammatory parameters, we identified the ANKRD55 interactomes from human neuroblastoma, astrocytic, microglial and monocytic cell lines. Methods Cell lines were transfected with synthetic ANKRD55 RNA in conjunction with nanoparticles. ANKRD55 interactomes were determined by affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) and analyzed bioinformatically. Results were validated and interpreted using confocal immunofluorescence microscopy, RNAseq transcriptomics, and a visible immunoprecipitation assay (VIP). Results Shared among the interactomes were the 14-3-3 isoforms 14-3-3η and 14-3-3βη. Unique to the microglial interactome were eight proteins belonging to the intraflagellar transport complex B (IFT-B). The IFT-B complex is known to mediate anterograde protein trafficking from the base to the tip of cilia. The dimer IFT46-IFT56 was identified as the minimum entity of IFT-B needed to support interaction with ANKRD55. To verify whether ANKRD55 is a ciliar transport protein, we induced ciliogenesis by serum starvation. Primary ARL13B + cilia could be induced in the astrocytic and neuroblastoma, but not microglial, cell lines. By confocal microscopy, ANKRD55 was not detectable in these cilia but was enriched at the basal body. In the microglial cell line, ANKRD55 and IFT-B components were enriched at the centrosome. In two human primary myeloid cell models, monocyte-derived microglia (MoMG) and monocyte-derived dendritic cells (MoDC), we were able to recapitulate the co-localization of ANKRD55 and IFT81 at the centrosome. Discussion Our work shows that an ANKRD55 – IFT-B-like complex is assembled in microglial cells. Together with the finding that ANKRD55 was not detected in primary cilia, the results suggest that ANKRD55 is associated with an IFT-B pathway that can operate independent of ciliogenesis.