The microbiota in individual habitats differ both in relative composition and absolute abundance. While sequencing approaches determine only the relative abundances of taxa and genes, experimental techniques for absolute abundance determination are rarely applied to large-scale microbiome studies. Here, we developed a machine learning approach to predict fecal microbial loads (microbial cells per gram) solely from relative abundance data. Applied to large-scale datasets (n = 34,539), we demonstrate that microbial load is the major determinant of gut microbiome variation and associated with numerous host factors. We found that for several diseases, the altered microbial load, not the disease itself, was the main driver of the gut microbiome changes. Adjusting for this effect substantially reduced the significance of more than half of the disease-associated species. Our analysis reveals that the fecal microbial load is a major confounder in microbiome studies, highlighting its importance for understanding microbiome variation in health and disease.

Objective: Gut microbial products are involved in type 2 diabetes, obesity and insulin resistance. In particular, hippurate, a hepatic phase 2 conjugation product of microbial benzoate metabolism, has been associated with a healthy phenotype. This study aims to identify metagenomic determinants and test protective effects of hippurate. Design: We profiled the urine metabolome by 1H Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy to derive associations with metagenomic sequences in 271 middle-aged Danish individuals to identify dietary patterns in which urine hippurate levels were associated with health benefits. We follow up with benzoate and hippurate infusion in mice to demonstrate causality on clinical phenotypes. Results: In-depth analysis identifies that the urine hippurate concentration is associated with microbial gene richness, microbial functional redundancy as well as functional modules for microbial benzoate biosynthetic pathways across several enterotypes. Through dietary stratification, we identify a subset of study participants consuming a diet rich in saturated fat in which urine hippurate, independently of gene richness, accounts for links with metabolic health that we previously associated with gene richness. We then demonstrate causality in vivo through chronic subcutaneous infusions of hippurate or benzoate (20 nmol/day) resulting in improved glycemic control in mice fed a high-fat diet. Hippurate improved insulin secretion through increased β-cell mass and reduced liver inflammation and fibrosis, whereas benzoate treatment resulted in liver inflammation. Conclusion: Our translational study shows that the benzoate-hippurate pathway brings a range of metabolic improvements in the context of high-fat diets, highlighting the potential of hippurate as a mediator of metabolic health.

Introduction: The chemical composition of feces plays an important role in human metabolism. Metabolomics and lipidomics are valuable tools for screening the metabolite composition in feces. Here we set out to describe fecal metabolite composition in healthy participants in frozen stools. Methods: Frozen stool samples were collected from 10 healthy volunteers and cryogenically drilled in four areas along the specimen. Polar metabolites were analyzed using derivatization followed by two-dimen-sional gas chromatography and time of flight mass spectrometry. Lipids were detected using ultra high-performance liquid chromatography coupled with quadruple time-of-flight mass spectrometry. The technical variation threshold was set to 30% in pooled quality control samples and metabolite variation was then assessed in four areas per specimen. A data-generated network using metabolites found in all areas was computed for healthy participants. Results: 2326 metabolic features were detected. Out of a total of 298 metabolites that were annotated we report here 185 that showed a technical variation of x< 30%. These metabolites included amino acids, fatty acid derivatives, carboxylic acids and phenolic compounds. Lipids predominantly belonged to the groups of diacylglycerols, triacylglycerols and ceramides. Metabolites varied between sampling areas (14%-80%). A network using metabolites present in all areas showed two main clusters, DAG lipids and phenyllactic acid. Conclusions: In feces from healthy participants, the main groups detected were phenolic compounds, ceramides, diacylglycerols and triacylglycerols. Metabolite levels differed considerably depending on the sampling area.