Abstract Protein aggregation correlates with many human diseases. Protein aggregates differ in shape, ranging from amorphous aggregates to amyloid fibrils. Possibly for such heterogeneity, strategies to develop effective aggregation inhibitors that reach the clinic failed so far. Here, we present a new strategy by which we developed a family of peptides targeting early aggregation stages for both amorphous and fibrillar aggregates of proteins unrelated in sequence and structure. Thus, they act on dynamic precursors before a mechanistic differentiation takes place. Using a peptide array approach, we first identified peptides inhibiting the predominantly amorphous aggregation of a molten globular, aggregation-prone protein, a thermolabile mutant of the Axin tumor suppressor. A series of optimization steps revealed that the peptides activity did not depend on their sequences but rather on their molecular determinants. The key properties that made a peptide active were a composition of 20-30% flexible, 30-40% aliphatic and 20-30% aromatic residues, a hydrophobicity/hydrophilicity ratio close to 1 and an even distribution of residues of different nature throughout the sequence. Remarkably, the optimized peptides also suppressed fibrillation of Tau, a disordered protein that forms amyloids in Alzheimer’s disease, and entirely unrelated to Axin. Our compounds thus target early aggregation stages, independent of the aggregation mechanism, inhibiting both amorphous and amyloid aggregation. Such cross-mechanistic, multi-targeting aggregation inhibitors may be attractive lead compounds against multiple protein aggregation diseases.

Protein aggregation correlates with many human diseases. Protein aggregates differ in structure and shape. Strategies to develop effective aggregation inhibitors that reach the clinic failed so far. Here, we developed a family of peptides targeting early aggregation stages for both amorphous and fibrillar aggregates of proteins unrelated in sequence and structure. They act on dynamic precursors before mechanistic differentiation takes place. Using peptide arrays, we first identified peptides inhibiting the amorphous aggregation of a molten globular, aggregation‐prone mutant of the Axin tumor suppressor. Optimization revealed that the peptides activity did not depend on their sequences but rather on their molecular determinants: a composition of 20‐30% flexible, 30‐40% aliphatic and 20‐30% aromatic residues, a hydrophobicity/hydrophilicity ratio close to 1, and an even distribution of residues of different nature throughout the sequence. The peptides also suppressed fibrillation of Tau, a disordered protein that forms amyloids in Alzheimer’s disease, and slowed down that of Huntingtin Exon1, an amyloidogenic protein in Huntington’s disease, both entirely unrelated to Axin. Our compounds thus target early aggregation stages of different aggregation mechanisms, inhibiting both amorphous and amyloid aggregation. Such cross‐mechanistic, multi‐targeting aggregation inhibitors may be lead compounds for developing drug candidates against various protein aggregation diseases.

Abstract SARS-CoV-2 infection triggers strong antibody response toward Nucleocapsid-Protein (NP), suggesting extracellular presence beyond its intra-virion RNA binding. Interestingly, NP was found to decorate infected and proximal uninfected cell-surfaces. Here, we propose a new mechanism through which extracellular NP on uninfected cells contributes to COVID-19 pathogenicity. We show that NP binds to cell-surface sulfated linear-glycosaminoglycans by spatial rearrangement of its RNA-binding sites facilitated by the flexible, positively charged, linker. Coating of uninfected lung-derived cells with purified NP attracted anti-NP-IgG from lung fluids and sera collected from COVID-19 patients. The magnitude of this immune recognition was significantly elevated in moderate compared to mild COVID-19 cases. Importantly, binding of anti-NP-IgG present in sera generated clusters that triggered C3b deposition by the classical complement pathway. Heparin analog enoxaparin outcompeted NP-binding, rescuing cells from anti-NP IgG-mediated complement deposition. Our findings unveil how extracellular NP may exacerbate COVID-19 tissue damage, and suggest leads for preventative therapy. Abstract Figure Highlights IgG from patients’ sera target NP-bound cells resulting in complement activation The flexible linker allows NP to both bind linear sulfated GAGs and wrap around RNA Heparin analogs prevent NP surface binding and alleviate complement activation Cell-ELISA anti-NP IgG levels differ between mild and moderate COVID-19

Protein aggregation is related to the development of amyloid diseases, such as Alzheimers Disease and Huntingtons Disease. It is of great importance to detect aggregates at the earliest stage possible, which is a prerequisite for early diagnosis. Here, we present a method to monitor protein fibril size from early aggregation steps. We designed a peptide, FibrilPaint1, that specifically recognises and fluorescently labels various fibrils from diseases, but not their monomeric precursors. In combination with Flow Induced Dispersion Analysis, a microfluidics technology, we determined the molecular size of amyloid fibrils with sub-microliter sample volumes. FibrilPaint1 specifically detects structurally unrelated fibrils from Huntingtin and Tau, including ex vivo samples derived from Alzheimers Disease, Frontotemporal Dementia and Corticobasal Degeneration patients. The ability to recognise multiple amyloids but not monomeric precursors makes FibrilPaint1 a novel tool for diagnostic applications for amyloid diseases.

Neurodegenerative diseases, such as Alzheimer Disease, Parkinson Disease, Huntington Disease, are characterised by accumulation of amyloid fibrils. To date, there is no cure for these diseases, and it is of great importance to develop disease-modifying therapies. Recently, we discovered the FibrilPaint1 peptide, a specific amyloid binder. Here we introduce a class of FibrilPaint1 derivatives that bind to fibrils. The alterations include variation of the charge, termini and order of residues. As a result, we generated a class of peptides with general fibril-binding properties and with the potential for further adaptation, such as linkage to multiple dyes, optimisation for specific protein and aggregate strains, or adaptation for targeted protein degradation strategies. Thus, FibrilPaint peptides are a class of promising drug leads for targeting amyloid fibrils for therapeutic and diagnostic purposes.

Abstract Neurodegenerative diseases are characterised by the progressive loss of neuronal tissue, and the accumulation of amyloid fibrils. Currently, there are no therapeutics that remove these amyloids. Targeted protein degradation could be a promising strategy to remove fibrils or oligomeric precursors. This approach requires degraders that specifically recognise amyloid fibrils, preferentially in early stages. Here, we introduce FibrilPaint20 (FP20), a peptide that specifically mediates the ubiquitination of amyloid fibrils. It acts as a PROTAC, containing both of a fibril recognition module and a recruitment motif for the E3 ubiquitin ligase CHIP. Importantly, FP20 does not bind to the functional monomer but exclusively to fibrils. Remarkably, FP20 ubiquitinates a set chemically diverse fibrils, unrelated in sequence and morphology. This includes fibrils of the disease-related proteins of α-synuclein, Aβ, Huntingtin and various Tau species, such as patient-derived fibrils from Alzheimer, Frontotemporal Dementia and Corticobasal Degeneration. This makes FP20 interesting for targeting mixed pathologies. Together, FP20 is an attractive lead compound for targeted protein degradation of amyloid fibrils.