Mixed antiestrogens, such as 4-hydroxytamoxifen (4HT), act as either partial agonists or antagonists of estrogen receptor (ER) function in a tissue-, cell-, and promoter-specific manner, suggesting that intracellular factors modulate their ability to regulate transcription. To determine whether coactivators and corepressors have the capacity to modulate the relative agonist/antagonist activity of 4HT, ER-dependent gene expression was measured in the absence or presence of expression vectors for SRC-1 (steroid receptor coactivator-1) or SMRT (silencing mediator of retinoic acid and thyroid hormone receptors). In Hep G2 cells in which 4HT is an agonist, exogenous SRC-1 enhanced estradiol (E2)- and 4HT-stimulated transcription in a dose-dependent manner, while SMRT overexpression strongly reduced basal and 4HT-stimulated gene expression with no effect on E2 activity. These observations were not cell- or promoter-specific inasmuch as similar results were obtained in HeLa cells under conditions in which 4HT is an antagonist. A protein-protein interaction assay indicated that the full-length ER binds to SMRT in vitro. To assess whether relative coactivator and corepressor expression within a given cell could modulate the balance of 4HT agonist/antagonist activity, SRC-1 and SMRT were coexpressed. SMRT overexpression blocked SRC-1 coactivation of 4HT-stimulated gene expression and preferentially inhibited 4HT agonist activity whether or not exogenous SRC-1 was present. The cumulative data in this model system indicate that the relative expression of coactivators and corepressors can modulate 4HT regulation of ER transcriptional activity and suggest they could contribute to the tissue-specific ability of mixed antiestrogens to activate or inhibit ER-mediated gene expression.

We present evidence that both corepressors SMRT and N-CoR exist in large protein complexes with estimated sizes of 1.5-2 MDa in HeLa nuclear extracts. Using a combination of conventional and immunoaffinity chromatography, we have successfully isolated a SMRT complex and identified histone deacetylase 3 (HDAC3) and transducin (beta)-like I (TBL1), a WD-40 repeat-containing protein, as the subunits of the purified SMRT complex. We show that the HDAC3-containing SMRT and N-CoR complexes can bind to unliganded thyroid hormone receptors (TRs) in vitro. We demonstrate further that in Xenopus oocytes, both SMRT and N-CoR also associate with HDAC3 in large protein complexes and that injection of antibodies against HDAC3 or SMRT/N-CoR led to a partial relief of repression by unliganded TR/RXR. These findings thus establish both SMRT and N-CoR complexes as bona fide HDAC-containing complexes and shed new light on the molecular pathways by which N-CoR and SMRT function in transcriptional repression.

In eukaryotic cells, the ubiquitin–proteasome pathway is the major mechanism for the targeted degradation of proteins with short half-lives. The covalent attachment of ubiquitin to lysine residues of targeted proteins is a signal for the recognition and rapid degradation by the proteasome, a large multi-subunit protease. In this report, we demonstrate that the human estrogen receptor (ER) protein is rapidly degraded in mammalian cells in an estradiol-dependent manner. The treatment of mammalian cells with the proteasome inhibitor MG132 inhibits activity of the proteasome and blocks ER degradation, suggesting that ER protein is turned over through the ubiquitin–proteasome pathway. In addition, we show that in vitro ER degradation depends on ubiquitin-activating E1 enzyme (UBA) and ubiquitin-conjugating E2 enzymes (UBCs), and the proteasome inhibitors MG132 and lactacystin block ER protein degradation in vitro . Furthermore, the UBA/UBCs and proteasome inhibitors promote the accumulation of higher molecular weight forms of ER. The UBA and UBCs, which promote ER degradation in vitro , have no significant effect on human progesterone receptor and human thyroid hormone receptor β proteins.

Estrogen receptor-α (ERα) is downregulated in the presence of its cognate ligand, estradiol (E2), through the ubiquitin proteasome pathway. Here, we show that ubiquitin proteasome function is required for ERα to serve as a transcriptional activator. Deletion of the last 61 amino acids of ERα, including residues that form helix 12, abolishes ligand-mediated downregulation of the receptor as do point mutations in the ligand binding domain that impair coactivator binding. In addition, coactivators also are subject to degradation by the 26S proteasome, but their intrinsic transcriptional activity is not affected. These data provide evidence that protein interactions with ERα coactivator binding surfaces are important for ligand-mediated receptor downregulation and suggest that receptor and coactivator turnover contributes to ERα transcriptional activity.

In this study, we found that the E6-associated protein (E6-AP/UBE3A) directly interacts with and coactivates the transcriptional activity of the human progesterone receptor (PR) in a hormone-dependent manner. E6-AP also coactivates the hormone-dependent transcriptional activities of the other members of the nuclear hormone receptor superfamily. Previously, it was shown that E6-AP serves the role of a ubiquitin-protein ligase (E3) in the presence of the E6 protein from human papillomavirus types 16 and 18. Our data show that the ubiquitin-protein ligase function of E6-AP is dispensable for its ability to coactivate nuclear hormone receptors, showing that E6-AP possesses two separable independent functions, as both a coactivator and a ubiquitin-protein ligase. Disruption of the maternal copy of E6-AP is correlated with Angelman syndrome (AS), a genetic neurological disorder characterized by severe mental retardation, seizures, speech impairment, and other symptoms. However, the exact mechanism by which the defective E6-AP gene causes AS remains unknown. To correlate the E6-AP coactivator function and ubiquitin-protein ligase functions with the AS phenotype, we expressed mutant forms of E6-AP isolated from AS patients and assessed the ability of each of these mutant proteins to coactivate PR or provide ubiquitin-protein ligase activity. This analysis revealed that in the majority of the AS patients examined, the ubiquitin-protein ligase function of E6-AP was defective whereas the coactivator function was intact. This finding suggests that the AS phenotype results from a defect in the ubiquitin-proteosome protein degradation pathway.

Abstract Tumor-associated carbohydrate antigens (TACAs) can promote tumor growth by regulating the anti-tumor immune response. The accumulation of immune suppressor cells within the tumor in response to TACAs suggests a critical pathway to suppress immune targeting of the tumor. Employing murine breast cancer models, we isolated a regulatory B cell subpopulation in the breast tumor microenvironment that displays an immune suppressive phenotype through its Tn TACA-binding lectin, CD301b. We then demonstrated that depleting CD301b + cells facilitated tumor control and mouse survival, whereas increasing Tn antigen expression decreased mouse survival. As tumor cells use Tn expression to overcome immune targeting, interfering with or blocking the Tn-CD301 axis may unleash the immune system, specifically within the aberrantly glycosylated tumor microenvironment, offering new immunotherapy for breast and other cancers.