Prostate cancer is a heterogeneous disease, but current treatments are not based on molecular stratification. We hypothesized that metastatic, castration-resistant prostate cancers with DNA-repair defects would respond to poly(adenosine diphosphate [ADP]–ribose) polymerase (PARP) inhibition with olaparib.

The tumour suppressor gene, phosphatase and tensin homolog (PTEN), is one of the most commonly mutated genes in human cancers. Recent evidence suggests that PTEN is important for the maintenance of genome stability. Here, we show that PTEN deficiency causes a homologous recombination (HR) defect in human tumour cells. The HR deficiency caused by PTEN deficiency, sensitizes tumour cells to potent inhibitors of the DNA repair enzyme poly(ADP-ribose) polymerase (PARP), both in vitro and in vivo. PARP inhibitors are now showing considerable promise in the clinic, specifically in patients with mutations in either of the breast cancer susceptibility genes BRCA1 or BRCA2. The data we present here now suggests that the clinical assessment of PARP inhibitors should be extended beyond those with BRCA mutations to a larger group of patients with PTEN mutant tumours.

53BP1 is a chromatin-binding protein that regulates the repair of DNA double-strand breaks by suppressing the nucleolytic resection of DNA termini

Abstract Although PARP inhibitors (PARPi) target homologous recombination defective tumours, drug resistance frequently emerges, often via poorly understood mechanisms. Here, using genome-wide and high-density CRISPR-Cas9 “tag-mutate-enrich” mutagenesis screens, we identify close to full-length mutant forms of PARP1 that cause in vitro and in vivo PARPi resistance. Mutations both within and outside of the PARP1 DNA-binding zinc-finger domains cause PARPi resistance and alter PARP1 trapping, as does a PARP1 mutation found in a clinical case of PARPi resistance. This reinforces the importance of trapped PARP1 as a cytotoxic DNA lesion and suggests that PARP1 intramolecular interactions might influence PARPi-mediated cytotoxicity. PARP1 mutations are also tolerated in cells with a pathogenic BRCA1 mutation where they result in distinct sensitivities to chemotherapeutic drugs compared to other mechanisms of PARPi resistance ( BRCA1 reversion, 53BP1 , REV7 ( MAD2L2 ) mutation), suggesting that the underlying mechanism of PARPi resistance that emerges could influence the success of subsequent therapies.

Small-molecule inhibitors of PARP1/2, such as olaparib, have been proposed to serve as a synthetic lethal therapy for cancers that harbor BRCA1 or BRCA2 mutations. Indeed, in clinical trials, PARP1/2 inhibitors elicit sustained antitumor responses in patients with germline BRCA gene mutations. In hypothesizing that additional genetic determinants might direct use of these drugs, we conducted a genome-wide synthetic lethal screen for candidate olaparib sensitivity genes. In support of this hypothesis, the set of identified genes included known determinants of olaparib sensitivity, such as BRCA1, RAD51, and Fanconi's anemia susceptibility genes. In addition, the set included genes implicated in established networks of DNA repair, DNA cohesion, and chromatin remodeling, none of which were known previously to confer sensitivity to PARP1/2 inhibition. Notably, integration of the list of candidate sensitivity genes with data from tumor DNA sequencing studies identified CDK12 deficiency as a clinically relevant biomarker of PARP1/2 inhibitor sensitivity. In models of high-grade serous ovarian cancer (HGS-OVCa), CDK12 attenuation was sufficient to confer sensitivity to PARP1/2 inhibition, suppression of DNA repair via homologous recombination, and reduced expression of BRCA1. As one of only nine genes known to be significantly mutated in HGS-OVCa, CDK12 has properties that should confirm interest in its use as a biomarker, particularly in ongoing clinical trials of PARP1/2 inhibitors and other agents that trigger replication fork arrest.

Article3 April 2008free access A synthetic lethal siRNA screen identifying genes mediating sensitivity to a PARP inhibitor Nicholas C Turner Nicholas C Turner The Breakthrough Breast Cancer Research Centre, The Institute of Cancer Research, London, UK Search for more papers by this author Christopher J Lord Christopher J Lord The Breakthrough Breast Cancer Research Centre, The Institute of Cancer Research, London, UK Search for more papers by this author Elizabeth Iorns Elizabeth Iorns The Breakthrough Breast Cancer Research Centre, The Institute of Cancer Research, London, UK Search for more papers by this author Rachel Brough Rachel Brough The Breakthrough Breast Cancer Research Centre, The Institute of Cancer Research, London, UK Search for more papers by this author Sally Swift Sally Swift The Breakthrough Breast Cancer Research Centre, The Institute of Cancer Research, London, UK Search for more papers by this author Richard Elliott Richard Elliott The Breakthrough Breast Cancer Research Centre, The Institute of Cancer Research, London, UK Search for more papers by this author Sydonia Rayter Sydonia Rayter The Breakthrough Breast Cancer Research Centre, The Institute of Cancer Research, London, UK Search for more papers by this author Andrew N Tutt Andrew N Tutt The Breakthrough Breast Cancer Research Centre, The Institute of Cancer Research, London, UK Breakthrough Breast Cancer Research Unit, King's College London School of Medicine, Guy's Hospital, London, UK Search for more papers by this author Alan Ashworth Corresponding Author Alan Ashworth The Breakthrough Breast Cancer Research Centre, The Institute of Cancer Research, London, UK Search for more papers by this author Nicholas C Turner Nicholas C Turner The Breakthrough Breast Cancer Research Centre, The Institute of Cancer Research, London, UK Search for more papers by this author Christopher J Lord Christopher J Lord The Breakthrough Breast Cancer Research Centre, The Institute of Cancer Research, London, UK Search for more papers by this author Elizabeth Iorns Elizabeth Iorns The Breakthrough Breast Cancer Research Centre, The Institute of Cancer Research, London, UK Search for more papers by this author Rachel Brough Rachel Brough The Breakthrough Breast Cancer Research Centre, The Institute of Cancer Research, London, UK Search for more papers by this author Sally Swift Sally Swift The Breakthrough Breast Cancer Research Centre, The Institute of Cancer Research, London, UK Search for more papers by this author Richard Elliott Richard Elliott The Breakthrough Breast Cancer Research Centre, The Institute of Cancer Research, London, UK Search for more papers by this author Sydonia Rayter Sydonia Rayter The Breakthrough Breast Cancer Research Centre, The Institute of Cancer Research, London, UK Search for more papers by this author Andrew N Tutt Andrew N Tutt The Breakthrough Breast Cancer Research Centre, The Institute of Cancer Research, London, UK Breakthrough Breast Cancer Research Unit, King's College London School of Medicine, Guy's Hospital, London, UK Search for more papers by this author Alan Ashworth Corresponding Author Alan Ashworth The Breakthrough Breast Cancer Research Centre, The Institute of Cancer Research, London, UK Search for more papers by this author Author Information Nicholas C Turner1, Christopher J Lord1, Elizabeth Iorns1, Rachel Brough1, Sally Swift1, Richard Elliott1, Sydonia Rayter1, Andrew N Tutt1,2 and Alan Ashworth 1 1The Breakthrough Breast Cancer Research Centre, The Institute of Cancer Research, London, UK 2Breakthrough Breast Cancer Research Unit, King's College London School of Medicine, Guy's Hospital, London, UK *Corresponding author. The Breakthrough Breast Cancer Research Centre, The Institute of Cancer Research, 237 Fulham Road, London SW3 6JB, UK. Tel.: +44 0 20 7153 5333; Fax: +44 0 20 7153 5340; E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2008)27:1368-1377https://doi.org/10.1038/emboj.2008.61 PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Inhibitors of poly (ADP-ribose)-polymerase-1 (PARP) are highly lethal to cells with deficiencies in BRCA1, BRCA2 or other components of the homologous recombination pathway. This has led to PARP inhibitors entering clinical trials as a potential therapy for cancer in carriers of BRCA1 and BRCA2 mutations. To discover new determinants of sensitivity to these drugs, we performed a PARP-inhibitor synthetic lethal short interfering RNA (siRNA) screen. We identified a number of kinases whose silencing strongly sensitised to PARP inhibitor, including cyclin-dependent kinase 5 (CDK5), MAPK12, PLK3, PNKP, STK22c and STK36. How CDK5 silencing mediates sensitivity was investigated. Previously, CDK5 has been suggested to be active only in a neuronal context, but here we show that CDK5 is required in non-neuronal cells for the DNA-damage response and, in particular, intra-S and G2/M cell-cycle checkpoints. These results highlight the potential of synthetic lethal siRNA screens with chemical inhibitors to define new determinants of sensitivity and potential therapeutic targets. Introduction Poly (ADP-ribose)-polymerase-1 (PARP) is a highly abundant nuclear enzyme involved in the repair of single-strand breaks (SSBs) (Hoeijmakers, 2001). Inhibition of PARP induces accumulation of large numbers of unrepaired SSBs, leading to the collapse of replication forks during S-phase and the consequent generation of double-strand breaks (DSBs). Cells deficient in DNA DSB repair, in particular homologous recombination (HR) by gene conversion, are highly sensitive to chemical inhibitors of PARP (Bryant et al, 2005; Farmer et al, 2005; McCabe et al, 2006). In contrast, cells with intact DNA DSB-response pathways repair damage with high fidelity and accordingly show very little sensitivity to PARP inhibitors. The breast and ovarian cancer predisposition genes, BRCA1 and BRCA2, encode proteins that are required for efficient HR (Moynahan et al, 1999; Tutt et al, 2001). Tumours arising in the carriers of heterozygous germline BRCA mutations have generally lost the wild-type BRCA allele, resulting in defective HR, which may be targeted in a synthetic lethal approach (Farmer et al, 2005). PARP inhibitors have now entered clinical trials and initial results are promising, with frequent sustained responses in BRCA mutation carriers (Yap et al, 2007). Despite the clinical promise of PARP inhibitors in the treatment of BRCA-related cancer, extending the utility of these agents to other cancers is challenging. Little is known about the determinants of PARP-inhibitor sensitivity, other than the profound sensitivity of cells with defects in HR (McCabe et al, 2006). The identification of novel mediators of cellular response to PARP inhibitors may highlight additional patient populations that might benefit form this therapeutic approach. Furthermore, mechanisms of drug resistance and potential combination therapies may also be uncovered. RNA interference (RNAi) screens have the potential to identify novel determinants of drug response and hence enhance the application of novel and existing drugs (Iorns et al, 2007), and have already proven highly effective in the unbiased identification of novel genes involved in biological processes (Aza-Blanc et al, 2003; Mukherji et al, 2006). These screens exploit the naturally occurring mechanism of RNAi that controls gene expression at the post-transcriptional level by mediating degradation of mRNA transcripts in a sequence-specific fashion (Meister and Tuschl, 2004). With the development of RNAi libraries composed of reagents that allow targeting a wide range of transcripts, it is now possible to conduct high-throughput screens (HTS) that simultaneously interrogate phenotypes associated with the loss of function of many genes (Iorns et al, 2007). Here, we have used a high-throughput RNAi screen to identify new determinants of sensitivity to a PARP inhibitor. Results siRNA screen for kinases sensitising to a PARP inhibitor RNAi screens that have previously examined sensitivity to DNA-damaging chemotherapy drugs have been limited by the small relative sensitivity, or therapeutic window, that exists between cells that are sensitive and resistant, limiting screens to identification of genes that cause profound effects when silenced (Bartz et al, 2006). DNA DSB repair-deficient cells are potentially more than a thousandfold more sensitive than resistant cells to PARP inhibitor (Bryant et al, 2005; Farmer et al, 2005; McCabe et al, 2006), probably due to the specificity of the DNA damage induced, increasing the ability of a screen to detect significant but less sensitising effects. We performed a PARP inhibitor synthetic lethal screen with a short interfering RNA (siRNA) library targeting 779 human protein kinase and kinase-associated genes. We selected kinases as they represent drugable targets. CAL51 cells were used for the screen, which are a diploid, TP53 wild-type breast cancer cell line. The HTS assay involved transfecting CAL51 cells with siRNA in a 96-well plate format and dividing the cells the day after transfection into replica plates, treating half with the PARP inhibitor KU0058948 and half with the vehicle (Figure 1A). The screen was optimised to detect modestly sensitising effects by using a dose of KU0058948 sufficient to inhibit the repair of SSBs (data not shown) and equivalent to the SF80 (80% survival after KU0058948 administration). Furthermore, cells were exposed to drug continuously for 5 days to allow multiple cell cycles to occur, allowing effects of PARP inhibition to accumulate and modelling chronic exposure to these drugs in the clinic. Figure 1.PARP-inhibitor synthetic lethality screen with protein kinase siRNA library. (A) HTS method. CAL51 cells plated in 96-well plates were transfected with siRNA. Each transfection plate contained 80 experimental siRNAs (SMARTPools of four different siRNA targeting the same gene) supplemented with four wells of non-targeting siCON, and two wells of siRNA directed against BRCA1 (positive control). Transfected cells were divided into six replica plates, half treated with DMSO vehicle alone and half with PARP inhibitor KU0058948 at 1 μM, the SF80 of CAL51. Cell viability was assessed after 5 days of KU0058948 exposure using CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega). (B) Reproducibility of HTS method. Correlation of the effect of siRNA on cell growth in vehicle-treated plates from two replicates of the entire screen. Spearman correlation coefficient, r=0.83. (C) Correlation of KU0058948 sensitivity Z-scores from two replicates of the entire screen. r=0.54. (D) Scatter plot of averaged Z-scores from PARP inhibitor sensitivity screen carried out in duplicate with KU0058948. Red line indicates −3 averaged Z-score significance threshold. Black, siRNA (SMARTPools) targeting 779 protein kinase genes; red, siCON and blue, siBRCA1. Reflecting the reproducibility and sensitivity of the screen, siCON and siBRCA1 Z-scores were widely separated, with a screen Z′-factor (Zhang et al, 1999) of 0.34. Download figure Download PowerPoint The screen was completed in duplicate. Comparison of the two duplicates revealed the screen to be highly reproducible (Figure 1B and C). The duplicates of the screen were combined in the final results of the screen displayed in Figure 1D. A robust significance or ‘hit’ threshold of a combined Z-score of −3 or less was selected, with 24 gene-specific siRNA pools (SMARTPools®; Dharmacon) fulfilling this criterion (Table I). Full results of the screen are supplied as Supplementary Table 1. Internal validation of the high sensitivity of the screen was provided by the demonstration that siRNAs targeting the key DNA-damage response genes, ataxia–telangiectasia related (ATR), ataxia–telangiectasia mutated (ATM) and CHK1, significantly sensitised to the PARP inhibitor (Table I), as we have previously reported (McCabe et al, 2006), emphasising the importance of intact DNA DSB-response pathways in tolerance to PARP inhibitors. Table 1. Results of PARP inhibitor synthetic lethal siRNA screen siRNA SMARTpool® KU0058948-sensitivity Z-score Growth % siCONTROL IMPK −8.33 96 PNKP −8.21 54 ATR −7.27 106 TTBK1 −6.31 60 STK36 −5.50 65 PLK1 −5.15 6 STK35 −5.09 77 CDC2 −4.17 55 ADRA1A −4.15 56 PIP5K2B −4.10 48 PLK3 −3.99 73 ITGB1BP1 −3.94 86 STK22C −3.85 87 AKAP1 −3.64 48 FLJ34389 −3.35 63 GSK3A −3.32 78 CHEK1 −3.26 42 CDK5 −3.18 106 ATM −3.12 92 MAPK12 −3.11 59 PMVK −3.07 83 DAPK1 −3.07 66 MGC5601 −3.05 52 PRKD2 −3.00 97 Results of siRNA screen displayed in Z-score order with siRNA SMARTpool target gene, KU0058948 PARP-inhibitor sensitivity Z-score and the effect of siRNA on cell growth in vehicle-alone plates. The first 24 siRNAs are statistically significant, with a Z-score of less than −3. Hits in bold italic have well-documented roles in the DNA-damage response, and have previously been shown to sensitise to PARP inhibitors. Hits in boldface are revalidated in subsequent experiments as being on-target. Statistically significant hits 21–24 were not further revalidated. Validation of siRNA screen hits In addition to silencing a target gene, siRNAs potentially suppress the expression of a large number of other genes through off-target effects. Therefore, we repeated the HTS assay separately with each of the four different siRNA species included in the original SMARTPool®. The HTS results were likely to be ‘on-target’ when two or more individual siRNA targeting the same gene sensitised to KU0058948 (Echeverri et al, 2006). The top 20 hits from the screen were re-examined (Table I), excluding ATR, ATM and CHK1 as we have established previously that these are determinants of KU0058948 sensitivity (McCabe et al, 2006). Of the remaining 17 hits, 11 were potentially shown to be due to off-target effects of single-siRNA species (data not shown). The six on-target hits (Figure 2A) were cyclin-dependent kinase 5 (CDK5, Entrez GeneID 1020), which revalidated with all four individual siRNAs; polynucleotide kinase 3′-phosphatase (PNKP, aka PNK, GeneID 11284) positive with three siRNAs and mitogen-activated protein kinase 12 (MAPK12, aka P38γ, GeneID 6300), Polo-like kinase 3 (PLK3, GeneID 1263), serine/threonine kinase 36 (STK36, fused homologue, GeneID 27148) and serine/threonine kinase 22C (STK22C, aka TSSK3, GeneID 81629), all of which revalidated with two siRNAs. We repeated the PARP sensitivity assay in HeLa cells, a cervical carcinoma cell line. Silencing of CDK5, MAPK12, PNPK and STK22C significantly sensitised to PARP inhibitor in this cell line (Supplementary Figure 3), confirming the effects we had seen in CAL51 cells. However, PLK3 silencing had no effect on PARP-inhibitor sensitivity in HeLa cells, suggesting the mechanism of sensitivity following PLK3 silencing might be restricted to specific cell lines. To establish the sensitivity of the revalidated on-target hits to PARP inhibitor, dose–response relationships were determined by clonogenic assay following SMARTpool® siRNA silencing (Figure 2B). All six hits dramatically sensitised cells to KU0058948 (10- to 102-fold sensitivity). Confirmation of gene silencing by siRNA was performed by quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) (Supplementary Figure 1). Figure 2.Validation of PARP-inhibitor synthetic lethality screen. (A) Validation of hits from the PARP inhibitor HTS. PARP inhibitor sensitivity assay repeated in triplicate with the four different siRNA originally included in each SMARTPool. The surviving fractions following PARP inhibition are shown, including those after transfection with siBRCA1 (blue) and siCON (red). CDK5 revalidated with all four siRNA; PNKP revalidated with three siRNAs; and MAPK12, PLK3, STK36 and STK22C revalidated with two siRNA. As an example of a probable off-target hit, ADRA1A silencing sensitises to PARP inhibitor due to an off-target effect of the fourth siRNA. *P<0.0227 compared with siCON (Student's t-test). Error bars represent the s.e.m. (B) PARP-inhibitor sensitivity assessed by clonogenic assay in the six novel validated hits from the screen. Error bars represent s.e.m. of three independent experiments. Download figure Download PowerPoint CDK5 functions in the DNA-damage response CDK5 is an unusual CDK, previously thought to be active only in post-mitotic neurones due to the perceived neuronal-specific expression of its activators, CDK5R1 (p35) and CDK5R2 (p39) (Dhavan and Tsai, 2001). In non-neuronal cells, no role for CDK5 in the DNA-damage response has previously been suggested and we, therefore, chose to examine the biological significance of CDK5 silencing and the mechanism of sensitivity to PARP inhibitor in more detail. Having confirmed CDK5 silencing by siRNA (Supplementary Figure 1), we initially investigated whether CDK5 silencing sensitised to other DNA-damaging agents. CDK5-silenced cells were also more sensitive than control cells to camptothecin and cisplatin (Figure 3A), but not to the microtubule poison docetaxel (data not shown), suggesting that the effect of CDK5 silencing was not restricted to DNA damage by PARP inhibition. This was accompanied by induction of an apoptotic response following DNA damage in CDK5-silenced cells (Figure 3B). An early marker of the presence of DNA DSBs is the phosphorylation of the highly conserved histone H2AX. Following CDK5 knockdown, phosphorylated H2AX (γH2AX) foci were increased in the absence of exogenous DNA damage (Figure 3C). We examined whether the observed increase represented induction or persistence of γH2AX foci. While the basal level of γH2AX foci was increased in siCDK5-transfected (CDK5 SiRNA) cells, the resolution of ionising radiation-induced foci was similar to that in siCONTROL (siCON)-transfected cells (Supplementary Figure 2). This suggested that the increase in γH2AX foci following CDK5 silencing was due to increased induction of γH2AX and not persistence. This increase in γH2AX foci was also associated with a small, but significant, increase in RAD51 foci, a hallmark of repair by HR (Figure 3D). Figure 3.CDK5 silencing sensitises cells to DNA-damaging agents and induces a DNA-damage response. (A) Clonogenic survival assays in CAL51 cells transfected with siCDK5 or siCON and treated with camptothecin (SF50 siCON 33.5 nM, siCDK5 11.3 nM, threefold more sensitive) or cisplatin (SF50 siCON 13.8 μM, siCDK5 6.4 μM, 2.2-fold more sensitive). (B) Sensitivity to DNA damage in CDK5-silenced cells is characterised by an increase in apoptosis. FACS plots showing Annexin V and propidium iodide (PI) staining after treatment with hydrogen peroxide and either siCON or siCDK5 transfection. Percentages of Annexin V-positive/PI-negative cells were as follows: siCON-transfected cells, 3.4% (−H2O2) and 4.5% (+H2O2); siCDK5-transfected cells, 6.2% (−H2O2) and 10.4% (+H2O2). (C) CDK5 silencing induces γH2AX foci formation. The panels indicate confocal microscopic images from siCON- and siCDK5-transfected cells, with red indicating γH2AX and blue indicating ToPro3 DNA staining. Quantification of cells with ⩾5 γH2AX foci from three independent experiments. Error bars represent s.e.m.; silencing of CDK5 P=0.031 relative to siCON (Student's t-test). Silencing of BRCA2 acted as a control, P>0.05 relative to siCON. (D) CDK5 silencing induces basal RAD51 foci formation. Quantification of basal RAD51 foci, and RAD51 foci 5 h after 8-Gy irradiation (non-irradiated, siCDK5 transfected 17% versus siCON 7%). Error bars represent s.e.m. of three independent experiments; *P=0.009 relative to siCON (Student's t-test). Silencing of BRCA2 acted as a control for impairment of the radiation-induced foci. Download figure Download PowerPoint CDK5 silencing, therefore, induced spontaneous formation of DNA DSB and induced markers of DNA DSB repair. We assessed the relevance of CDK5 kinase activity to PARP-inhibitor sensitivity by transiently expressing a dominant-negative, kinase-dead D145N CDK5 mutant (van den Heuvel and Harlow, 1993). This mutant differs from wild-type CDK5 in only a single amino-acid change that abrogates the kinase activity of CDK5 (van den Heuvel and Harlow, 1993). Expression of dominant-negative CDK5 sensitised to PARP inhibitor, whereas expression of exogenous wild-type CDK5 did not (Figure 4A). This suggested that kinase activity of CDK5 was required for tolerance of PARP inhibitors. CDK5 activity was examined by IP kinase assay. CDK5 kinase activity increased after irradiation in CAL51 cells (Supplementary Figure 2A). To address the possibility that ATM and CDK5 act in a common pathway, we performed epistasis experiments. We observed no significant difference in PARP-inhibitor sensitivity between ATM inhibition and ATM inhibition with additional CDK5 silencing, suggesting that CDK5 and ATM act in a common pathway that sensitises to PARP inhibitor (Supplementary Figure 2B). Figure 4.CDK5 is not required for early DNA DSB signalling or DNA DSB repair. (A) Expression of dominant-negative CDK5 sensitises to PARP inhibitor. CAL51 cells transfected with empty vector (pcDNA3.1empty), CDK5 expression vector (pCDK5) or kinase-dead D145N CDK5 expression vector, and 24 h following transfection plated for clonogenic assay with KU0058948. (B) CDK5 is not required for ATM and ATR activation. CAL51 cells transfected 72 h earlier with siRNA where treated with 10-Gy irradiation, 50 J/m2 ultraviolet light or not treated. Lystates where made 1 h following treatment, and a western blot was probed with antibodies against ATM Ser1981 autophosphorylation site and CHK1 Ser317 ATM/ATR phosphorylation site, with total ATM, CHK1, TP53 and a β-Tubulin loading control. (C) CDK5 does not affect homologous recombination by gene conversion. Gene conversion was measured using an adapted single-copy, chromosomally integrated HR reporter construct in a 293 human embryonic kidney cell line (Tutt et al, 2001). Silencing of BRCA1 acted as a positive control for reduced gene conversion. Details of this assay are outlined in Supplementary Figure 4. (D) CDK5 silencing does not affect DNA DSB end joining. FIGE assay in CAL51 cells transfected with siCDK5 or siCON. Time points represent minutes after 30 Gy irradiation and non-irradiated control (NIR). Download figure Download PowerPoint The potential mechanism of sensitivity to PARP inhibitor following CDK5 silencing was also investigated. We first examined the integrity of early DNA DSB-damage signalling. Following CDK5 silencing there was normal autophosphorylation of ATM on serine 1981 following irradiation, and normal phosphorylation of CHK1 on serine 317 after ultraviolet light exposure, indicating retained ATR signalling (Jazayeri et al, 2006; Figure 4B). Induction of TP53 expression following irradiation was also normal following CDK5 silencing. CDK5 was therefore not required for activation of ATM or ATR following DNA damage, and most likely functioned downstream of initial DNA-damage signalling. The integrity of DNA DSB repair pathways, one determinant of PARP-inhibitor sensitivity (Farmer et al, 2005; McCabe et al, 2006), was investigated in CDK5-silenced cells. Two main DNA DSB repair pathways predominate, HR by gene conversion and non-homologous end joining (NHEJ) (Hoeijmakers, 2001). We measured gene conversion using an adapted single-copy, chromosomally integrated HR reporter construct present in a 293 cell line (Tutt et al,2001; described in Supplementary Figure 4). Transfection of cells with BRCA1 siRNA significantly reduced HR in this assay (Figure 4C), as expected, of a well-defined HR gene. Silencing of CDK5 had no detectable effect on HR (Figure 4C), in keeping with the normal formation of irradiation-induced RAD51 foci (Figure 3D). We also confirmed this observation using a green fluorescent protein reporter of HR (Pierce et al, 1999; Supplementary Figure 5). NHEJ was assessed using field-inversion gel electrophoresis (FIGE) to measure gross DNA fragmentation following irradiation. NHEJ was also found to be normal in siCDK5-transfected cells (Figure 4D). We conclude that, although CDK5 is required for response to DNA damage, and activated after DNA damage, it is not directly required for DNA DSB repair. CDK5 is required for DNA-damage checkpoint activation A number of partially overlapping DNA-damage response pathways regulate the cell cycle following DNA damage. The intra-S-phase checkpoint inhibits firing of new replication origins after DNA damage, causing a relative decrease in DNA synthesis after irradiation (Bartek et al, 2004). Following CDK5 silencing, radiation-resistant DNA synthesis (RDS) was assayed by 3H-labelled thymidine DNA incorporation and was shown to increase, suggesting a defect in the intra-S-phase checkpoint (Figure 5A). The magnitude of RDS after CDK5 silencing was comparable to that previously observed with silencing of MDC1, a protein crucial to activation of the intra-S-phase checkpoint (Goldberg et al, 2003). We compared the intra-S-phase checkpoint defect in siCDK5-transfected cells with that in cells with ATM-kinase activity inhibited. There was no significant difference in the magnitude of RDS between siCDK5-transfected cells and those treated with a concentration of the small-molecule inhibitor KU0055933 known to effectively abolish ATM-kinase activity (Hickson et al, 2004; Figure 5A, relative DNA incorporation siCDK5 66% versus ATM inhibitor 72%, P=0.48). A defect in the intra-S-checkpoint was also observed in cells transfected with a series of different siRNAs targeting CDK5 (Supplementary Figure 2), and in HeLa cells (Supplementary Figure 3), suggesting this phenotype was unlikely to be the result of off-target effects nor specific to CAL51 cells. Figure 5.CDK5 is required for cell-cycle DNA-damage checkpoints. (A) CDK5 is required for the intra-S-phase checkpoint. 3H-labelled thymidine incorporation was assessed by scintillation counting in an assay of radiation resistant DNA synthesis. DNA synthesis in cells irradiated 1 hour earlier with 10-Gy expressed relative to non-irradiated cells. Error bars represent s.e.m. of three independent experiments. Relative DNA synthesis after irradiation 45% siCON versus 66% siCDK5, *P=0.033 (Student's t-test). Right panel, DNA synthesis in untransfected CAL51 cells and CAL51 cells exposed to 10 μM KU0055933 (ATM inhibitor), relative DNA synthesis 45 versus 72%, respectively P<0.01. (B, C) CDK5 is required for G2/M checkpoint function. (B) FACS plots of cells stained with propidium iodide and an antibody directed against the mitosis marker phospho-histone H3. Mitotic cells are highlighted in the box. (C) Quantification of three independent experiments, with proportion of mitotic cells after irradiation expressed relative to non-irradiated cells. Error bars represent s.e.m. of three independent experiments. Relative mitotic entry after irradiation 12% siCON versus 42% siCDK5; *P=0.017 (Student's t-test). Right panel, mitotic entry in untransfected CAL51 cells and CAL51 cells exposed to 10 μM KU0055933 (ATM inhibitor), relative mitotic entry 11 versus 97%, respectively; P<0.001. Download figure Download PowerPoint Genes involved in the intra-S-phase checkpoint are frequently involved in the G2/M checkpoint that prevents cells with unrepaired DNA damage from entering mitosis by arresting the cell cycle at the G2/M transition (Mailand et al, 2002). Following CDK5 silencing, an abnormally high percentage of cells remained in mitosis after irradiation, suggesting significant defect in the G2/M checkpoint (Figure 5B and C), although it should be noted that the siCDK5-mediated effect was modest compared with that of ATM inhibition. A modest G2/M defect was also observed in HeLa cells transfected with siCDK5. This supports our contention of a generally applicable non-neuronal role for CDK5 in the DNA-damage response. Discussion Our screen has identified new determinants of sensitivity to PARP inhibitors and highlights how the functional profiling of new cancer drugs may become valuable in the drug development process (Iorns et al, 2007). PARP inhibitors are showing considerable promise as cancer drugs in early clinical trials (Yap et al, 2007), and the work described here identifies new avenues of research to extend the utility of these agents. We have demonstrated that sensitivity to PARP inhibitors can result from defective DNA-damage cell-cycle checkpoints, identifying a novel mechanism of sensitivity to PARP inhibitors. We envisage that tumours with reduced or no expression of the genes identified by us might be selectively sensitive to PARP inhibitors, as has been shown for BRCA1- and BRCA2-deficient cells. In addition, this screen has identified therapeutic targets whose inhibition would potentially synergise with PARP inhibitors in the clinic. Of the novel determinants of PARP sensitivity identified in our screen, some have been previously linked to DNA-damage response pathways. PNKP is a DNA kinase/phosphatase enzyme involved in the processing of damaged DNA ends prior to ligation. PNKP has previously been shown to be involved the repair of SSBs (Jilani et al, 1999) and also in DNA DSBs repair by NHEJ (Chappell et al, 2002). It will be interesting to elucidate which of these potential mechanisms underlie the sensitivity to PARP inhibitors on PNKP silencing. PLK3 has previously been suggested to have a role in the G2/M checkpoint following irradiation (Bahassi el et al, 2004), and in

Abstract Identifying genetic biomarkers of synthetic lethal drug sensitivity effects provides one approach to the development of targeted cancer therapies. Mutations in ARID1A represent one of the most common molecular alterations in human cancer, but therapeutic approaches that target these defects are not yet clinically available. We demonstrate that defects in ARID1A sensitize tumour cells to clinical inhibitors of the DNA damage checkpoint kinase, ATR, both in vitro and in vivo . Mechanistically, ARID1A deficiency results in topoisomerase 2A and cell cycle defects, which cause an increased reliance on ATR checkpoint activity. In ARID1A mutant tumour cells, inhibition of ATR triggers premature mitotic entry, genomic instability and apoptosis. The data presented here provide the pre-clinical and mechanistic rationale for assessing ARID1A defects as a biomarker of single-agent ATR inhibitor response and represents a novel synthetic lethal approach to targeting tumour cells.

Rare truncating mutations in the p53-inducible protein phosphatase PPM1D are shown to be associated with predisposition to breast cancer and ovarian cancer; notably, all of the mutations are mosaic in white blood cells but are not present in tumours, and probably have a gain-of-function effect. PPM1D is a p53-induced protein phosphatase that is upregulated in response to DNA damage. This study reports rare truncating mutations in PPM1D that are associated with predisposition to breast and ovarian cancer, with a cumulative risk of 23% and 18%, respectively by the age of 80. Unusually, these are gain-of-function mutations, despite being truncations. Even more unusually they are mosaic in normal tissues but lost from all tumours analysed, indicating a potentially novel mode of action. Improved sequencing technologies offer unprecedented opportunities for investigating the role of rare genetic variation in common disease. However, there are considerable challenges with respect to study design, data analysis and replication1. Using pooled next-generation sequencing of 507 genes implicated in the repair of DNA in 1,150 samples, an analytical strategy focused on protein-truncating variants (PTVs) and a large-scale sequencing case–control replication experiment in 13,642 individuals, here we show that rare PTVs in the p53-inducible protein phosphatase PPM1D are associated with predisposition to breast cancer and ovarian cancer. PPM1D PTV mutations were present in 25 out of 7,781 cases versus 1 out of 5,861 controls (P = 1.12 × 10−5), including 18 mutations in 6,912 individuals with breast cancer (P = 2.42 × 10−4) and 12 mutations in 1,121 individuals with ovarian cancer (P = 3.10 × 10−9). Notably, all of the identified PPM1D PTVs were mosaic in lymphocyte DNA and clustered within a 370-base-pair region in the final exon of the gene, carboxy-terminal to the phosphatase catalytic domain. Functional studies demonstrate that the mutations result in enhanced suppression of p53 in response to ionizing radiation exposure, suggesting that the mutant alleles encode hyperactive PPM1D isoforms. Thus, although the mutations cause premature protein truncation, they do not result in the simple loss-of-function effect typically associated with this class of variant, but instead probably have a gain-of-function effect. Our results have implications for the detection and management of breast and ovarian cancer risk. More generally, these data provide new insights into the role of rare and of mosaic genetic variants in common conditions, and the use of sequencing in their identification.

Abstract The PSMC3IP-MND1 heterodimer promotes RAD51 and DMC1-dependent D-loop formation during meiosis in yeast and mammalian organisms. For this purpose, it catalyzes the DNA strand exchange activities of the recombinases. Interestingly, in a panel of genome-scale CRISPR-Cas9 mutagenesis and interference screens in mitotic cells, we found that depletion of either PSMC3IP or MND1 caused sensitivity to clinical Poly (ADP-Ribose) Polymerase inhibitors (PARPi). A retroviral mutagenesis screen in mitotic cells also identified PSMC3IP and MND1 as genetic determinants of ionizing radiation sensitivity. The role PSMC3IP and MND1 play in preventing PARPi sensitivity in mitotic cells appears to be independent of a previously described role in alternative lengthening of telomeres (ALT). PSMC3IP or MND1 depleted cells accumulate toxic RAD51 foci in response to DNA damage, show impaired homology-directed DNA repair, and become PARPi sensitive, even in cells lacking both BRCA1 and TP53BP1 . Although replication fork reversal is also affected, the epistatic relationship between PSMC3IP-MND1 and BRCA1/BRCA2 suggests that the abrogated D-loop formation is the major cause of PARPi sensitivity. This is corroborated by the fact that a PSMC3IP p.Glu201del D-loop formation mutant associated with ovarian dysgenesis fails to reverse PARPi sensitivity. These observations suggest that meiotic proteins such as MND1 and PSMC3IP could have a greater role in mitotic cells in determining the response to therapeutic DNA damage.