The aim of this study was to determine whether tumor necrosis factor-alpha (TNFalpha) and receptors for TNFalpha are expressed in the exocrine pancreas, and whether pancreatic acinar cells release and respond to TNFalpha. Reverse transcription PCR, immunoprecipitation, and Western blot analysis demonstrated the presence of TNFalpha and 55- and 75-kD TNFalpha receptors in pancreas from control rats, rats with experimental pancreatitis induced by supramaximal doses of cerulein, and in isolated pancreatic acini. Immunohistochemistry showed TNFalpha presence in pancreatic acinar cells. ELISA and bioassay measurements of TNFalpha indicated its release from pancreatic acinar cells during incubation in primary culture. Acinar cells responded to TNFalpha. TNFalpha potentiated NF-kappaB translocation into the nucleus and stimulated apoptosis in isolated acini while not affecting LDH release. In vivo studies demonstrated that neutralization of TNFalpha with an antibody produced a mild improvement in the parameters of cerulein-induced pancreatitis. However, TNFalpha neutralization greatly inhibited apoptosis in a modification of the cerulein model of pancreatitis which is associated with a high percentage of apoptotic cell death. The results indicate that pancreatic acinar cells produce, release, and respond to TNFalpha. This cytokine regulates apoptosis in both isolated pancreatic acini and experimental pancreatitis.

One reason why pancreatic cancer is so aggressive and unresponsive to treatments is its resistance to apoptosis. We report here that reactive oxygen species (ROS) are a prosurvival, antiapoptotic factor in pancreatic cancer cells. Human pancreatic adenocarcinoma MIA PaCa-2 and PANC-1 cells generated ROS, which was stimulated by growth factors (serum, insulin-like growth factor I, or fibroblast growth factor-2). Growth factors also stimulated membrane NAD(P)H oxidase activity in these cells. Both intracellular ROS and NAD(P)H oxidase activity were inhibited by antioxidants tiron and N-acetylcysteine and the inhibitor of flavoprotein-dependent oxidases, diphenylene iodonium, but not by inhibitors of various other ROS-generating enzymes. Using Rho0 cells deficient in mitochondrial DNA, we showed that a nonmitochondrial NAD(P)H oxidase is a major source of growth factor-induced ROS in pancreatic cancer cells. Among proteins that have been implicated in NAD(P)H oxidase activity, MIA PaCa-2 and PANC-1 cells do not express the phagocytic gp91phox subunit but express several nonphagocytic oxidase (NOX) isoforms. Transfection with Nox4 antisense oligonucleotide inhibited NAD(P)H oxidase activity and ROS production in MIA PaCa-2 and PANC-1 cells. Inhibiting ROS with the antioxidants, Nox4 antisense, or MnSOD overexpression all stimulated apoptosis in pancreatic cancer cells as measured by internucleosomal DNA fragmentation, phosphatidylserine externalization, cytochrome c release, and effector caspase activation. The results show that growth factor-induced ROS produced by NAD(P)H oxidase (probably Nox4) protect pancreatic cancer cells from apoptosis. This mechanism may play an important role in pancreatic cancer resistance to treatment and thus represent a novel therapeutic target. One reason why pancreatic cancer is so aggressive and unresponsive to treatments is its resistance to apoptosis. We report here that reactive oxygen species (ROS) are a prosurvival, antiapoptotic factor in pancreatic cancer cells. Human pancreatic adenocarcinoma MIA PaCa-2 and PANC-1 cells generated ROS, which was stimulated by growth factors (serum, insulin-like growth factor I, or fibroblast growth factor-2). Growth factors also stimulated membrane NAD(P)H oxidase activity in these cells. Both intracellular ROS and NAD(P)H oxidase activity were inhibited by antioxidants tiron and N-acetylcysteine and the inhibitor of flavoprotein-dependent oxidases, diphenylene iodonium, but not by inhibitors of various other ROS-generating enzymes. Using Rho0 cells deficient in mitochondrial DNA, we showed that a nonmitochondrial NAD(P)H oxidase is a major source of growth factor-induced ROS in pancreatic cancer cells. Among proteins that have been implicated in NAD(P)H oxidase activity, MIA PaCa-2 and PANC-1 cells do not express the phagocytic gp91phox subunit but express several nonphagocytic oxidase (NOX) isoforms. Transfection with Nox4 antisense oligonucleotide inhibited NAD(P)H oxidase activity and ROS production in MIA PaCa-2 and PANC-1 cells. Inhibiting ROS with the antioxidants, Nox4 antisense, or MnSOD overexpression all stimulated apoptosis in pancreatic cancer cells as measured by internucleosomal DNA fragmentation, phosphatidylserine externalization, cytochrome c release, and effector caspase activation. The results show that growth factor-induced ROS produced by NAD(P)H oxidase (probably Nox4) protect pancreatic cancer cells from apoptosis. This mechanism may play an important role in pancreatic cancer resistance to treatment and thus represent a novel therapeutic target. Pancreatic adenocarcinoma is an aggressive malignancy resistant to chemotherapy and radiotherapy (1Wanebo H.J. Vezeridis M.P. Cancer. 1996; 78: 580-591Crossref PubMed Scopus (0) Google Scholar). One mechanism mediating pancreatic cancer aggressiveness and unresponsiveness to treatment is its resistance to apoptosis. Constitutive activation of antiapoptotic proteins such as transcription factors NF-κB (2Aggarwal B.B. Biochem. Pharmacol. 2000; 60: 1033-1039Crossref PubMed Scopus (147) Google Scholar) and signal transducers and activators of transcription (3Battle T.E. Frank D.A. Curr. Mol. Med. 2002; 2: 381-392Crossref PubMed Scopus (252) Google Scholar), heat shock proteins (4Beere H.M. Green D.R. Trends Cell Biol. 2001; 11: 6-10Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (387) Google Scholar), or phosphatidylinositide 3-kinase (5Nicholson K.M. Anderson N.G. Cell Signal. 2002; 14: 381-395Crossref PubMed Scopus (1394) Google Scholar) is thought to contribute to pancreatic cancer resistance to apoptosis. We hypothesized that a key factor mediating this resistance is ROS 1The abbreviations used are: ROS, reactive oxygen species; CMX-Ros, MitoTracker Red; DPI, diphenylene iodonium; FACS, fluorescence-activated cell sorter; FBS, fetal bovine serum; FGF-2, basic fibroblast growth factor; IGF-I, insulin-like growth factor-I; MnSOD, manganese superoxide dismutase; mtDNA, mitochondrial DNA; NAC, N-acetylcysteine; AMC, aminomethylcoumarin; NOS, nitric-oxide synthase; PLA2, phospholipase A2; DCFH-DA, 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate; CHAPS, 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonic acid; NOX, nonphagocytic oxidase; ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay; l-NAME, N-ω-nitro-l-arginine methyl ester; AACOCF3, arachidonyl trifluoromethylketone. generated in pancreatic cancer cells. Although ROS have long been thought to promote cell death (6Simon H.U. Haj-Yehia A. Levi-Schaffer F. Apoptosis. 2000; 5: 415-418Crossref PubMed Scopus (2313) Google Scholar, 7Kannan K. Jain S.K. Pathophysiology. 2000; 7: 153-163Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (936) Google Scholar, 8Davis Jr., W. Ronai Z. Tew K.D. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2001; 296: 1-6PubMed Google Scholar), recent data (9Wedgwood S. Black S.M. Am. J. Physiol. 2003; 285: L305-L312PubMed Google Scholar, 10Clement M.V. Stamenkovic I. EMBO J. 1996; 15: 216-225Crossref PubMed Scopus (234) Google Scholar, 11Lin K.I. Pasinelli P. Brown R.H. Hardwick J.M. Ratan R.R. J. Biol. Chem. 1999; 274: 13650-13655Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (32) Google Scholar, 12Brar S.S. Corbin Z. Kennedy T.P. Hemendinger R. Thornton L. Bommarius B. Arnold R.S. Whorton A.R. Sturrock A.B. Huecksteadt T.P. Quinn M.T. Krenitsky K. Ardie K.G. Lambeth J.D. Hoidal J.R. Am. J. Physiol. 2003; 285: C353-C369Crossref PubMed Scopus (226) Google Scholar) suggest that they may also play a prosurvival role. ROS can activate the above mentioned antiapoptotic signaling pathways. In this regard, we recently showed (13Mouria M. Gukovskaya A.S. Jung Y. Buechler P. Hines O.J. Reber H.A. Pandol S.J. Int. J. Cancer. 2002; 98: 761-769Crossref PubMed Scopus (263) Google Scholar) that compounds with antioxidative properties, quercetin, resveratrol and genistein, stimulated apoptosis of pancreatic cancer cells both in vitro and in vivo. ROS are highly reactive O2 metabolites that include superoxide radical (O2−˙), hydrogen peroxide (H2O2), and hydroxyl radical (OH·) (14Thannickal V.J. Fanburg B.L. Am. J. Physiol. 2000; 279: L1005-L1028Crossref PubMed Google Scholar). Large quantities of ROS are produced by phagocytes, mediating host defense against invading microorganisms (15Babior B.M. Lambeth J.D. Nauseef W. Arch. Biochem. Biophys. 2002; 397: 342-344Crossref PubMed Scopus (712) Google Scholar). ROS generation was also detected in nonphagocytic cells (14Thannickal V.J. Fanburg B.L. Am. J. Physiol. 2000; 279: L1005-L1028Crossref PubMed Google Scholar, 16Li J.M. Shah A.M. J. Biol. Chem. 2002; 277: 19952-19960Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (341) Google Scholar, 17Lassegue B. Clempus R.E. Am. J. Physiol. 2003; 285: R277-R297Crossref PubMed Scopus (21) Google Scholar). Human tumor cells produce significant amounts of ROS, albeit smaller than in phagocytes (18Szatrowski T.P. Nathan C.F. Cancer Res. 1991; 51: 794-798PubMed Google Scholar). Sources of cellular ROS include leakage from the mitochondrial electron transport chain as well as a number of ROS-generating plasma membrane and cytosolic enzymes (14Thannickal V.J. Fanburg B.L. Am. J. Physiol. 2000; 279: L1005-L1028Crossref PubMed Google Scholar). In phagocytes, large amounts of ROS are produced during the oxidative burst by the plasma membrane NAD(P)H oxidase, a well characterized multicomponent enzyme with gp91phox and p22phox catalytic subunits that together form an integral complex called flavocytochrome b558 (15Babior B.M. Lambeth J.D. Nauseef W. Arch. Biochem. Biophys. 2002; 397: 342-344Crossref PubMed Scopus (712) Google Scholar). Recently, proteins of the nonphagocytic oxidase (NOX) family homologous to gp91phox have been shown to generate ROS in nonphagocytic, in particular cancer, cells (12Brar S.S. Corbin Z. Kennedy T.P. Hemendinger R. Thornton L. Bommarius B. Arnold R.S. Whorton A.R. Sturrock A.B. Huecksteadt T.P. Quinn M.T. Krenitsky K. Ardie K.G. Lambeth J.D. Hoidal J.R. Am. J. Physiol. 2003; 285: C353-C369Crossref PubMed Scopus (226) Google Scholar, 19Lambeth J.D. Curr. Opin. Hematol. 2002; 9: 11-17Crossref PubMed Scopus (232) Google Scholar, 20Bokoch G.M. Knaus U.G. Trends Biochem. Sci. 2003; 28: 502-508Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (351) Google Scholar, 21Brar S.S. Kennedy T.P. Sturrock A.B. Huecksteadt T.P. Quinn M.T. Whorton A.R. Hoidal J.R. Am. J. Physiol. 2002; 282: C1212-C1224Crossref PubMed Scopus (138) Google Scholar). Furthermore, functional components of the phagocytic NAD(P)H oxidase have been found to mediate superoxide production in some nonphagocytic cells (22Cheng G. Cao Z. Xu X. van Meir E.G. Lambeth J.D. Gene (Amst.). 2001; 269: 131-140Crossref PubMed Scopus (707) Google Scholar, 23Takeya R. Ueno N. Kami K. Taura M. Kohjima M. Izaki T. Nunoi H. Sumimoto H. J. Biol. Chem. 2003; 278: 25234-25246Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (326) Google Scholar). Other ROS-generating enzymes are xanthine oxidase, nitric-oxide synthase (NOS), phospholipase A2 (PLA2), and lipoxygenases (14Thannickal V.J. Fanburg B.L. Am. J. Physiol. 2000; 279: L1005-L1028Crossref PubMed Google Scholar). A growing body of evidence indicates that ROS play signaling roles in physiologic and pathophysiologic processes, including proliferation (24Sauer H. Wartenberg M. Hescheler J. Cell Physiol. Biochem. 2001; 11: 173-186Crossref PubMed Scopus (929) Google Scholar), adhesion (25Chiarugi P. Pani G. Giannoni E. Taddei L. Colavitti R. Raugei G. Symons M. Borrello S. Galeotti T. Ramponi G. J. Cell Biol. 2003; 161: 933-944Crossref PubMed Scopus (366) Google Scholar), and hypertension (17Lassegue B. Clempus R.E. Am. J. Physiol. 2003; 285: R277-R297Crossref PubMed Scopus (21) Google Scholar, 26Li J.M. Shah A.M. J. Am. Soc. Nephrol. 2003; 14: S221-S226Crossref PubMed Google Scholar). In particular, growth factors are known to stimulate ROS in a variety of cell types through receptor-transducing pathways, although the detailed mechanism is poorly understood (14Thannickal V.J. Fanburg B.L. Am. J. Physiol. 2000; 279: L1005-L1028Crossref PubMed Google Scholar). Growth factor-induced ROS production is believed to be necessary for optimal propagation of mitogenic signals (24Sauer H. Wartenberg M. Hescheler J. Cell Physiol. Biochem. 2001; 11: 173-186Crossref PubMed Scopus (929) Google Scholar). Recent data have demonstrated an important role of ROS in neoplastic proliferation. Nox1 overexpression transforms normal fibroblasts and creates a cell line that is tumorigenic in athymic mice (27Suh Y.A. Arnold R.S. Lassegue B. Shi J. Xu X. Sorescu D. Chung A.B. Griendling K.K. Lambeth J.D. Nature. 1999; 401: 79-82Crossref PubMed Scopus (1284) Google Scholar, 28Arnold R.S. Shi J. Murad E. Whalen A.M. Sun C.Q. Polavarapu R. Parthasarathy S. Petros J.A. Lambeth J.D. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98: 5550-5555Crossref PubMed Scopus (423) Google Scholar). Nox4 was found to regulate growth of malignant melanoma cells (21Brar S.S. Kennedy T.P. Sturrock A.B. Huecksteadt T.P. Quinn M.T. Whorton A.R. Hoidal J.R. Am. J. Physiol. 2002; 282: C1212-C1224Crossref PubMed Scopus (138) Google Scholar); Nox5 was found to regulate growth of prostate cancer cells (12Brar S.S. Corbin Z. Kennedy T.P. Hemendinger R. Thornton L. Bommarius B. Arnold R.S. Whorton A.R. Sturrock A.B. Huecksteadt T.P. Quinn M.T. Krenitsky K. Ardie K.G. Lambeth J.D. Hoidal J.R. Am. J. Physiol. 2003; 285: C353-C369Crossref PubMed Scopus (226) Google Scholar). Compared with their roles in growth and proliferation, the effect of ROS on cell death is less well understood. Most data show that ROS stimulate cell death (6Simon H.U. Haj-Yehia A. Levi-Schaffer F. Apoptosis. 2000; 5: 415-418Crossref PubMed Scopus (2313) Google Scholar, 7Kannan K. Jain S.K. Pathophysiology. 2000; 7: 153-163Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (936) Google Scholar, 8Davis Jr., W. Ronai Z. Tew K.D. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2001; 296: 1-6PubMed Google Scholar). In particular, exogenous H2O2 causes apoptosis at low doses and necrosis at high doses (29Sakamoto T. Repasky W.T. Uchida K. Hirata A. Hirata F. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996; 220: 643-647Crossref PubMed Scopus (79) Google Scholar). Recent data suggest, however, that ROS inhibit apoptosis in smooth muscle (9Wedgwood S. Black S.M. Am. J. Physiol. 2003; 285: L305-L312PubMed Google Scholar), leukemia cells (10Clement M.V. Stamenkovic I. EMBO J. 1996; 15: 216-225Crossref PubMed Scopus (234) Google Scholar), colorectal (11Lin K.I. Pasinelli P. Brown R.H. Hardwick J.M. Ratan R.R. J. Biol. Chem. 1999; 274: 13650-13655Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (32) Google Scholar), and prostate cancer cells (12Brar S.S. Corbin Z. Kennedy T.P. Hemendinger R. Thornton L. Bommarius B. Arnold R.S. Whorton A.R. Sturrock A.B. Huecksteadt T.P. Quinn M.T. Krenitsky K. Ardie K.G. Lambeth J.D. Hoidal J.R. Am. J. Physiol. 2003; 285: C353-C369Crossref PubMed Scopus (226) Google Scholar). The prosurvival effect of ROS can be mediated through antiapoptotic redox-sensitive pathways known to be activated by ROS (e.g. NF-κB and heat shock proteins) (30Green D.R. Mol. Cell. 2003; 11: 551-552Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (48) Google Scholar, 31Garrido C. Gurbuxani S. Ravagnan L. Kroemer G. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001; 286: 433-442Crossref PubMed Scopus (669) Google Scholar). Little is known about the sources and the roles of ROS in pancreatic cancer cells. Inhibition of lipoxygenase (a putative source of ROS) as well as overexpression of an antioxidant enzyme, MnSOD, attenuated the growth of human pancreatic cancer cells (32Tong W.G. Ding X.Z. Witt R.C. Adrian T.E. Mol. Cancer Ther. 2002; 1: 929-935PubMed Google Scholar, 33Cullen J.J. Weydert C. Hinkhouse M.M. Ritchie J. Domann F.E. Spitz D. Oberley L.W. Cancer Res. 2003; 63: 1297-1303PubMed Google Scholar). The present study sought to determine the sources of ROS generation, their stimulation by growth factors, and whether ROS affect apoptosis in pancreatic cancer cells. We found that growth factors stimulate ROS generation by activating membrane nonmitochondrial NAD(P)H oxidase (probably Nox4) and that inhibiting ROS by different approaches stimulates apoptosis in pancreatic cancer cells. The prosurvival effect of ROS may be an important mechanism of pancreatic cancer cell resistance to therapy. Reagents—2′,7′-Dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) was from Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR); Ac-Asp-Glu-Val-Asp-AMC was from Peptide Institute, Inc. (Osaka, Japan); benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp(OMe)-CH2F was from Enzyme Systems Products (Livermore, CA). The Nox4 antibody generated from a His-tagged recombinant fragment of human Nox4 (encoding the C-terminal amino acids 494–513) was a gift from Dr. Barry J. Goldstein (Jefferson Medical College, Thomas Jefferson University, Philadelphia, PA). Anti-cytochrome c antibody was from PharMingen (San Diego, CA); anti-cytochrome c oxidase subunit IV antibody was from Molecular Probes; anti-MnSOD antibody was from Upstate Biotechnology, Inc. (Lake Placid, NY). All other reagents were from Sigma. Cell Culture—Human pancreatic adenocarcinoma cell lines, the poorly differentiated MIA PaCa-2 and moderately differentiated PANC-1, were obtained from the American Type Culture Collection (Manassas, VA). Cells were grown in 1:1 Dulbecco's modified Eagle's medium/F-12 medium (Gibco) supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS), 4 mm l-glutamine, and antibiotic/antimicotic solution (Omega Scientific, Tarzana, CA). Cells were maintained at 37 °C in a humidified atmosphere containing 5% CO2 and were used between passages 4 and 12. For analyses, cells were plated at a density of 5 × 105/ml in 100-mm culture dishes in the presence and absence of 15% FBS, 100 ng/ml insulin-like growth factor-I (IGF-I), and 50 ng/ml basic fibroblast growth factor (FGF-2) or the indicated inhibitors and cultured for up to 72 h in Dulbecco's modified Eagle's medium/F-12 medium. Generation of Rho0 Cells—MIA PaCa-2 Rho0 cells depleted of mitochondrial DNA (mtDNA) were generated by incubating wild type cells (Rho+) for 6–8 weeks with 100 ng/ml ethidium bromide. The medium was supplemented with 4.5 mg/ml glucose, 50 μg/ml uridine, and 100 μg/ml pyruvate to compensate for the respiratory metabolism deficit as previously described (34King M.P. Attardi G. Science. 1989; 246: 500-503Crossref PubMed Scopus (1465) Google Scholar, 35King M.P. Methods Enzymol. 1996; 264: 339-344Crossref PubMed Google Scholar). After selection, the MIA PaCa-2 Rho0 cells were cultured in the above specified medium without ethidium bromide. To verify the mtDNA depletion, total cellular DNA was extracted and subjected to PCR using two pairs of human mtDNA specific primers: 1) Mts1 (forward) (5′-cctagggataacagcgcaat) and Mtas1 (reverse) (5′-tagaagagcgatggtgagag), which gave a 630-bp product, and 2) Mts2 (forward) (5′-aacatacccatggccaacct) and Mtas2 (reverse) (5′-ggcaggagtaatcagaggtg), which gave a 532-bp product (36Hail Jr., N. Youssef E.M. Lotan R. Cancer Res. 2001; 61: 6698-6702PubMed Google Scholar, 37Park K.S. Nam K.J. Kim J.W. Lee Y.B. Han C.Y. Jeong J.K. Lee H.K. Pak Y.K. Am. J. Physiol. 2001; 280: E1007-E1014PubMed Google Scholar). For control, we measured the expression of β-actin, which is coded by chromosomal DNA. Measurement of Intracellular ROS Levels—Intracellular ROS levels were measured by flow cytometry in cells loaded with the redox-sensitive dye DCFH-DA (38Royall J.A. Ischiropoulos H. Arch. Biochem. Biophys. 1993; 302: 348-355Crossref PubMed Scopus (1050) Google Scholar). The nonfluorescent DCFH-DA readily diffuses into the cells, where it is hydrolyzed to the polar derivative DCFH, which is oxidized in the presence of H2O2 to the highly fluorescent DCF. Approximately 1 × 106 cells were incubated in the dark for 30 min at 37 °C with 10 μm DCFH-DA, harvested, and resuspended in the medium without DCFH-DA. Fluorescence was recorded on FL-1 channel of FACScan® (Becton Dickinson). Measurement of NAD(P)H Oxidase Activity—Superoxide production was measured in total cell homogenates or in membrane and cytosolic fractions by using lucigenin-derived chemiluminescence as described in Refs. 39Rajagopalan S. Kurz S. Munzel T. Tarpey M. Freeman B.A. Griendling K.K. Harrison D.G. J. Clin. Invest. 1996; 97: 1916-1923Crossref PubMed Scopus (2165) Google Scholar and 40Sorescu D. Somers M.J. Lassegue B. Grant S. Harrison D.G. Griendling K.K. Free Radic. Biol. Med. 2001; 30: 603-612Crossref PubMed Scopus (91) Google Scholar. Briefly, 50 μg of protein was diluted in 500 μl of 50 mm phosphate buffer containing 1 mm EGTA and 150 mm sucrose. Dark-adapted lucigenin was added to the sample, and chemiluminescence measurement was immediately started. Chemiluminescence (in arbitrary units) was measured at 15-s intervals for 1 min in a Turner 20/20 luminometer (Turner Designs, Sunnyvale, CA). NADPH or NADH (100 μm each) were used as substrates. The specificity of the measurement was confirmed by adding either a nonenzymatic superoxide scavenger, tiron (10 mm), or superoxide dismutase (200 units/ml; Sigma). In some experiments, the homogenate was preincubated for 30 min with various inhibitors of ROS-generating enzymes as described in the legend of Fig. 3. In this and other assays, protein concentration was measured by the Bradford assay (Bio-Rad). It has been shown (41Li Y. Zhu H. Kuppusamy P. Roubaud V. Zweier J.L. Trush M.A. J. Biol. Chem. 1998; 273: 2015-2023Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (480) Google Scholar, 42Janiszewski M. Souza H.P. Liu X. Pedro M.A. Zweier J.L. Laurindo F.R. Free Radic. Biol. Med. 2002; 32: 446-453Crossref PubMed Scopus (62) Google Scholar) that at high doses lucigenin can by itself stimulate additional superoxide production, which is especially pronounced with NADH as a substrate. This may result in overestimation of NAD(P)H oxidase activity in the homogenate. To exclude the artificial effect of lucigenin, we performed the following experiments. Chemiluminescence was measured in cell homogenates at 5, 25, 50, 100, and 200 μm lucigenin in the presence and absence of NADPH or NADH. At lucigenin concentrations 5–50 μm, the results showed much higher chemiluminescence with NADPH than with NADH. With 100–200 μm lucigenin, NADH-induced signals became larger than those induced by NADPH. The responses obtained with 5–50 μm but not with 100–200 μm lucigenin were blocked by DPI, an inhibitor of NAD(P)H-dependent oxidases. In accord with the data presented in Ref. 42Janiszewski M. Souza H.P. Liu X. Pedro M.A. Zweier J.L. Laurindo F.R. Free Radic. Biol. Med. 2002; 32: 446-453Crossref PubMed Scopus (62) Google Scholar, these results show that 5–50 μm lucigenin does not induce an artificial O2−˙ production in pancreatic cancer cells. The kinetics of the chemiluminescence response was the same with lucigenin concentrations 5–50 μm; however, the magnitude of the signal was greater at 25 and 50 μm. Thus, the data presented were obtained with 25 or 50 μm lucigenin. Preparation of Total Cell Lysates—Cells were incubated in a lysis buffer (0.5 mm EDTA, 150 mm NaCl, 50 Tris, 0.5% Nonidet P-40, pH 7.5) for 1 h at 4 °C and centrifuged for 10 min at 13,000 × g, and supernatants were collected and stored at –80 °C until assayed. Cell Fractionation—Cells were resuspended in a lysis buffer (250 mm sucrose, 20 mm HEPES, 10 mm KCl, 1 mm Na-EGTA, 1 mm Na-EDTA, 2 mm MgCl2, pH 7.0), allowed to swell for 30 min at 4 °C, and then disrupted by 80 strokes in a Dounce homogenizer. Homogenates were centrifuged at 1,000 × g to pellet nuclei and cell debris. Supernatants were centrifuged at 13,000 × g for 30 min, and the cytosolic fraction (supernatant) was collected. The pellet (heavy membranes enriched with mitochondria) was lysed in radioimmune precipitation buffer (0.15 m NaCl, 50 mm Tris, 1% deoxycholic acid, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, pH 7.2) for 1 h. To validate the quality of cytosolic and mitochondrial separation, both fractions were assessed by immunoblotting for the mitochondrial marker cytochrome c oxidase subunit IV. Reverse Transcription-PCR—The procedures were as we described previously (43Gukovsky I. Gukovskaya A.S. Blinman T.A. Zaninovic V. Pandol S.J. Am. J. Physiol. 1998; 275: G1402-G1414Crossref PubMed Google Scholar, 44Blinman T.A. Gukovsky I. Mouria M. Zaninovic V. Livingston E. Pandol S.J. Gukovskaya A.S. Am. J. Physiol. 2000; 279: C1993-C2003Crossref PubMed Google Scholar). Briefly, total RNA was obtained from pancreatic cancer cells with TRI reagent (Molecular Research Center, Cincinnati, OH) and reverse-transcribed using the SuperScript II preamplification kit (Invitrogen). cDNA derived from 0.5 μg of total RNA was subjected to PCR with human gene-specific, intron-spanning primers that are described in Table I. Target sequences were amplified at 56–58 °C. The reverse transcription-PCR products were all of the expected size (see Fig. 5).Table IPrimer sequences for human NAD(P)H subunitsmRNAForward primerReverse primerExpected sizeGenBank™ accession no.bpNox15′-acaaattccagtgtgcagaccac5′-agactggaatatcggtgacagca247AJ438989gp91phox (Nox2)5′-gggctgttcaatgcttgtggct5′-acatctttctcctcatcatggtgc413NM_000397Nox 35′-atgaacacctctggggtcagctga5′-ggatcggagtcactcccttcgctg458NM_015718Nox 45′-ctcagcggaatcaatcagctgtg5′-agaggaacacgacaatcagccttag286NM_016931Nox 55′-atcaagcggccccctttttttcac5′-ctcattgtcacactcctcgacagc630AF317889p22phox5′-gtgtttgtgtgcctgctggagt5′-ctgggcggctgcttgatggt320M21186p47phox5′-gtacccagccagcactatgtgt5′-aaagtagcctgtgacgtcgtct771NM_000265p67phox5′-ttcgagggaaccagctgataga5′-gcatgggaacactgagcttcac760M32011β-Actin5′-atgggtcagaaggattcctatgt5′-gaaggtctcaaacatgatctggg243NM_001101 Open table in a new tab Measurement of Mitochondrial Membrane Potential (Δψm)—Changes in Δψm were detected with the potential-sensitive probe MitoTracker Red (CMX-Ros; Molecular Probes), as we described previously (45Vaquero E.C. Edderkaoui M. Nam K.J. Gukovsky I. Pandol S.J. Gukovskaya A.S. Gastroenterology. 2003; 125: 1188-1202Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (69) Google Scholar). During the last 30 min of the incubation period, cells were loaded with 10 nm CMX-Ros for 30 min at 37 °C in the dark, washed twice with phosphate-buffered saline, and analyzed on the FACScan® using FL-3 detector. To completely dissipate Δψm, cells were treated with the uncoupling agent fluorocyanide m-chlorophenylhydrazone (FCCP; 50 μm) for 1 h before CMX-Ros staining. Transfections—Transient transfection with human MnSOD was performed using the LipofectAMINE 2000 reagent (Invitrogen). The pcDNA3-MnSOD plasmid was kindly provided by Dr. Larry W. Oberley (University of Iowa, Iowa City, IA). Transfection was done according to the manufacturer's instructions, using 5–8 μg of the plasmid DNA and 20 μl of LipofectAMINE for a 60-mm dish. Transfection efficiency was assessed by co-transfection of a green fluorescent protein plasmid. At 48 or 72 h post-transfection, cell lysates were collected, and the expression of the MnSOD protein was measured by Western blot analysis using a polyclonal anti-MnSOD antibody from Upstate Biotechnology. Transfection of MIA PaCa-2 and PANC-1 cells with Nox4 antisense oligonucleotide was done as described in Ref. 12Brar S.S. Corbin Z. Kennedy T.P. Hemendinger R. Thornton L. Bommarius B. Arnold R.S. Whorton A.R. Sturrock A.B. Huecksteadt T.P. Quinn M.T. Krenitsky K. Ardie K.G. Lambeth J.D. Hoidal J.R. Am. J. Physiol. 2003; 285: C353-C369Crossref PubMed Scopus (226) Google Scholar. 1.5 nmol of the Nox4 antisense phosphorthioate oligonucleotide, 5′-AGCTCCTCCAGGACACAGCC, was applied for a 60-mm dish. The Nox4 scrambled oligonucleotide, 5′-TCGAGGAGGTCCTGTGTCGG, was used as a control. 6 h post-transfection, fresh medium was supplied, and cells were cultured for an additional 48 or 72 h before the specified analyses. Western Blot Analysis—Proteins from cell lysates were separated by 4–20% SDS-PAGE (Invitrogen) and electrophoretically transferred to nitrocellulose membranes. Nonspecific binding was blocked with 5% milk in Tris-buffered saline (4 mm Tris base, 100 mm NaCl, pH 7.5). Membranes were washed in Tris-buffered saline containing 0.05% Tween 20 (TTBS) and incubated for 2 h with the indicated primary antibodies and then for 1 h with horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody. Blots were developed with the Supersignal Chemiluminescent Substrate (Pierce). Measurements of Apoptosis—Internucleosomal DNA fragmentation was measured by using the Cell Death Detection ELISAPlus kit (Roche Applied Science) according to the manufacturer's instructions. Absorbance values were normalized to cell number. Phosphatidylserine externalization was analyzed with the annexin-V-FLUOS staining kit from Roche Applied Science as we described before (45Vaquero E.C. Edderkaoui M. Nam K.J. Gukovsky I. Pandol S.J. Gukovskaya A.S. Gastroenterology. 2003; 125: 1188-1202Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (69) Google Scholar). Cells were collected and resuspended at a density of 1 × 106 cells in 500 μl of binding buffer containing 2 μl of annexin-V and 1 μlof propidium iodide, incubated in the dark for 30 min at room temperature, and analyzed by flow cytometry. Effector caspase (DEVDase) activity was measured by a fluorogenic assay in whole cell lysates using Ac-Asp-Glu-Val-Asp-AMC as a substrate, as we described before (45Vaquero E.C. Edderkaoui M. Nam K.J. Gukovsky I. Pandol S.J. Gukovskaya A.S. Gastroenterology. 2003; 125: 1188-1202Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (69) Google Scholar). The lysate (50–100 μg of protein) was incubated with 10 μm substrate in a reaction buffer (25 mm HEPES (pH 7.5), 10% sucrose, 0.1% CHAPS, 10 mm dithiothreitol) at 37 °C. Caspase substrate cleavage releases AMC, which emits fluorescent signal with 380-nm excitation and 440-nm emission. Fluorescence was measured in a Shimadzu RF-1501 spectrofluorimeter and calibrated using a standard curve for AMC. Cytochrome c release into the cytosol was assayed by Western blot analysis of cytosolic fractions, as we described previously (45Vaquero E.C. Edderkaoui M. Nam K.J. Gukovsky I. Pandol S.J. Gukovskaya A.S. Gastroenterology. 2003; 125: 1188-1202Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (69) Google Scholar). Statistical Analysis—Results are expressed as means ± S.E. from at least three independent experiments. Statistical analysis was done using unpaired Student's t test. The value of p < 0.05 was considered statistically significant. Growth Factors Stimulate Intracellular ROS Production in MIA PaCa-2 and PANC-1 Pancreatic Carcinoma Cells through Flavoprotein-dependent Oxidase—Using the redox-sensitive fluorescence probe DCFH-DA, we determined that growth factors stimulated ROS production in pancreatic cancer cell lines (Fig. 1). In both MIA PaCa-2 (Fig. 1, A and C–E) and PANC-1 cells (Fig. 1B), intracellular ROS

Serosal application of carbachol to T84 cell monolayers mounted in an Ussing chamber caused an immediate increase in short circuit current (Isc) that peaked within 5 min and declined rapidly thereafter, although a small increase in Isc persisted for approximately 30 min. The increase in Isc was detectable with 1 microM carbachol; half-maximal with 10 microM carbachol; and maximal with 100 microM carbachol. Unidirectional Na+ and Cl- flux measurements indicated that the increase in Isc was due to net Cl- secretion. Carbachol did not alter cellular cAMP, but caused a transient increase in free cytosolic Ca2+ ([Ca2+]i) from 117 +/- 7 nM to 160 +/- 15 nM. The carbachol-induced increase in Isc was potentiated by either prostaglandin E1 (PGE1) or vasoactive intestinal polypeptide (VIP), agents that act by increasing cAMP. Measurements of cAMP and [Ca2+]i indicated that the potentiated response was not due to changes in these second messengers. Studies of the effects of these agents on ion transport pathways indicated that carbachol, PGE1, or VIP each increased basolateral K+ efflux by activating two different K+ transport pathways on the basolateral membrane. The pathway activated by carbachol was not sensitive to barium, while that activated by PGE1 or VIP was; furthermore, their action on K+ efflux are additive. Our study indicates that carbachol causes Cl- secretion, and that this action may result from its ability to increase [Ca2+]i and basolateral K+ efflux. Carbachol's effect on Cl- secretion is greatly augmented in the presence of VIP or PGE1, which open a cAMP-sensitive Cl- channel on the apical membrane, accounting for a potentiated response.

Chronic pancreatitis (CP) is a progressive and irreversible inflammatory and fibrotic disease with no cure. Unlike acute pancreatitis (AP), we find that alternatively activated macrophages (AAMs) are dominant in mouse and human CP. AAMs are dependent on interleukin (IL)-4 and IL-13 signalling, and we show that mice lacking IL-4Rα, myeloid-specific IL-4Rα and IL-4/IL-13 were less susceptible to pancreatic fibrosis. Furthermore, we demonstrate that mouse and human pancreatic stellate cells (PSCs) are a source of IL-4/IL-13. Notably, we show that pharmacologic inhibition of IL-4/IL-13 in human ex vivo studies as well as in established mouse CP decreases pancreatic AAMs and fibrosis. We identify a critical role for macrophages in pancreatic fibrosis and in turn PSCs as important inducers of macrophage-alternative activation. Our study challenges and identifies pathways involved in crosstalk between macrophages and PSCs that can be targeted to reverse or halt pancreatic fibrosis progression. Chronic pancreatitis is an inflammatory disease accompanied by fibrosis. Here the authors show that pancreatic stellate cells produce IL-4 and IL-13 that trigger alternative activation of macrophages, and that genetic or pharmacological inhibition of IL-4/IL-13 signaling ameliorates the disease.

The pathogenic mechanisms underlying acute pancreatitis are not clear. Two key pathologic acinar cell responses of this disease are vacuole accumulation and trypsinogen activation. We show here that both result from defective autophagy, by comparing the autophagic responses in rodent models of acute pancreatitis to physiologic autophagy triggered by fasting. Pancreatitis-induced vacuoles in acinar cells were greater in number and much larger than those induced with fasting. Degradation of long-lived proteins, a measure of autophagic efficiency, was markedly inhibited in in vitro pancreatitis, while it was stimulated by acinar cell starvation. Further, processing of the lysosomal proteases cathepsin L (CatL) and CatB into their fully active, mature forms was reduced in pancreatitis, as were their activities in the lysosome-enriched subcellular fraction. These findings indicate that autophagy is retarded in pancreatitis due to deficient lysosomal degradation caused by impaired cathepsin processing. Trypsinogen activation occurred in pancreatitis but not with fasting and was prevented by inhibiting autophagy. A marker of trypsinogen activation partially localized to autophagic vacuoles, and pharmacologic inhibition of CatL increased the amount of active trypsin in acinar cells. The results suggest that retarded autophagy is associated with an imbalance between CatL, which degrades trypsinogen and trypsin, and CatB, which converts trypsinogen into trypsin, resulting in intra-acinar accumulation of active trypsin in pancreatitis. Thus, deficient lysosomal degradation may be a dominant mechanism for increased intra-acinar trypsin in pancreatitis.

ABSTRACT Objective Chronic pancreatitis (CP) is a potentially fatal disease of the exocrine pancreas, with no specific or effective approved therapies. Due to difficulty in accessing pancreas tissues, little is known about local immune responses or pathogenesis in human CP. We sought to characterize pancreas immune responses using tissues derived from patients with different etiologies of CP and non-CP organ donors in order to identify key signaling molecules associated with human CP. Design We performed single-cell level cellular indexing of transcriptomes and epitopes by sequencing (CITE-Seq) and T cell receptor sequencing of pancreatic immune cells isolated from organ donors, hereditary, and idiopathic CP patients who underwent total pancreatectomy. We validated gene expression data by performing flow cytometry and functional assay in the second CP patient cohort. Results Deep single-cell sequencing revealed distinct immune characteristics and significantly enriched CCR6 + CD4 + T cells in hereditary compared with idiopathic CP. In hereditary CP, a reduction in T cell clonality was observed due to the increased CD4 + T (Th) cells that replaced tissue-resident CD8 + T cells. Shared TCR clonotype analysis among T cell lineages also unveiled unique interactions between CCR6 + Th and Th1 subsets, and TCR clustering analysis showed unique common antigen binding motifs in hereditary CP. In addition, we observed a significant upregulation of the CCR6 ligand ( CCL20 ) among monocytes in hereditary CP as compared with those in idiopathic CP. The functional significance of CCR6 expression in CD4 + T cells was confirmed by flow cytometry and chemotaxis assay. Conclusion Single-cell sequencing with pancreatic immune cells in human CP highlights pancreas-specific immune crosstalk through the CCR6-CCL20 axis that might be leveraged as a potential future target in human hereditary CP. Significance of this study What is already known about this subject? Chronic pancreatitis (CP) is considered an irreversible fibroinflammatory pancreatic disease and remains a major source of morbidity among gastrointestinal diseases with no active approved therapy. Inflammation is a known hallmark and contributor to CP pathogenesis. However, little is known about local immune responses in human CP especially with different etiologies. What are the new findings? Single-cell RNA sequencing of pancreatic immune cells from CP patients and organ donors revealed distinct immune transcriptomic features in CP versus non-diseased controls and hereditary versus idiopathic CP. Single-cell T cell receptor sequencing unveiled pancreas-specific clonal expansion in CD8 + T cells and CD4 + T cells-driven unique TCR repertoire changes in hereditary CP. We identified that the CCR6-CCL20 axis was significantly upregulated in hereditary CP compared with controls or idiopathic CP suggesting a potential future target for human hereditary CP. How might it impact on clinical practice in the foreseeable future? The results of this study will improve our understanding of CP heterogeneity and identify distinct immune responses in different types of human CP that could provide novel conceptual directions for therapeutic strategies in treating hereditary and idiopathic CP. The CCR6-CCL20 axis found in hereditary CP could be a potential novel targetable signaling pathways in the treatment of hereditary CP.

Background/Objectives: Perinatal exposure to malnutrition has been hypothesised to influence the development of young-onset cancer (≤50 years of age). This study aimed to determine if perinatal malnutrition in individuals exposed to the Great Famine of China increased their risk of developing young-onset cancer compared to other individuals born prior to the famine. Subjects/Methods: This cross-sectional study involved 7272 participants from the China Health and Nutrition Survey who were classified into four groups based on birth year: participants born between 1953 and 1955 (before the famine) were designated as the pre-famine group (unexposed); the remainder formed perinatal exposure groups comprised of those exposed during the famine (1959–1961), those exposed in the early post-famine period (1962–1964), and those exposed in the late post-famine period (1965–1967). Multivariable adjusted log-binomial regression models were used to calculate the RR and 95% CI of young-onset cancer (including genitourinary cancer) across four groups. Results: Perinatal exposure to early post-famine (RR 2.08; 95%CI 1.04, 4.34; p = 0.043) and the female sex (RR 15.6, 95%CI 4.54, 60.3; p < 0.001) were noted to have a significantly increased risk of young-onset cancer. In addition, the early (RR 13.8; 95%CI 2.68, 253; p = 0.012) and late post-famine (RR 12.3; 95%CI 2.16, 231; p = 0.020) cohorts demonstrated a significantly increased risk of young-onset genitourinary cancer. The latter was accompanied by an increased risk of hypertension (RR 3.30; 95%CI 1.28, 7.87; p = 0.009). Conclusions: Perinatal exposure to famine, especially in females, was associated with a higher risk of young-onset cancer. This was particularly evident for young-onset genitourinary cancers. These findings highlight the potential long-term impact of perinatal malnutrition on young-onset carcinogenesis.

Background Ductal features alone may not offer high diagnostic sensitivity or most accurate disease severity of chronic pancreatitis (CP). Purpose Diagnose CP based on multiparametric MRI and MRCP features. Study Type Prospective. Population Between February 2019 and May 2021, 46 control (23 males, 49.3 ± 14.1 years), 45 suspected (20 males, 48.7 ± 12.5 years), and 46 definite (20 males, 53.7 ± 14.6 years) CP patients were enrolled at seven hospitals enrolled in the MINIMAP study. CP classification was based on imaging findings and clinical presentation. Field Strength and Sequences 1.5 T . T 1 ‐weighted ( T 1 W ) spoiled gradient echo, T1 map with variable flip angle, dual‐echo Dixon, secretin‐enhanced MRCP before and after secretin infusion. Assessment Dual‐echo fat fraction (FF), T 1 relaxation time, extracellular volume (ECV), T 1 signal intensity ratio of the pancreas to the spleen (T 1 score), arterial‐to‐venous enhancement ratio (AVR), pancreatic tail diameter (PTD), pancreas volume, late gadolinium enhancement, pancreatic ductal elasticity (PDE), and duodenal filling grade of secretin‐enhanced MRCP were measured. Statistical Tests Logistic regression analysis generated CP‐MRI and secretin‐enhanced CP‐SMRI scores. Receiver operating characteristics analysis was used to differentiate definite CP from control. Interobserver agreement was assessed using Lin's concordance correlation coefficient. Results Compared to control, definite CP cohort showed significantly higher dual‐echo FF (7% vs. 11%), lower AVR (1.35 vs. 0.85), smaller PTD (2.5 cm vs. 1.95 cm), higher ECV (28% vs. 38%), and higher incidence of PDE loss (6.5% vs. 50%). With the cut‐off of >2.5 CP‐MRI score (dual‐echo FF, AVR, and PTD) and CP‐SMRI score (dual‐echo FF, AVR, PTD, and PDE) had cross‐validated area under the curves of 0.84 (sensitivity 87%, specificity 68%) and 0.86 (sensitivity 89%, specificity 67%), respectively. Interobserver agreement for both CP‐MRI and CP‐SMRI scores was 0.74. Conclusion The CP‐MRI and CP‐SMRI scores yielded acceptable performance and interobserver agreement for the diagnosis of CP. Evidence Level 1 Technical Efficacy Stage 2