Glioblastomas are invasive brain tumors with high therapeutic resistance. Neuron-to-glioma synapses have been shown to promote glioblastoma progression. However, a characterization of tumor-connected neurons has been hampered by a lack of technologies. Here, we adapted retrograde tracing using rabies viruses to investigate and manipulate neuron-tumor networks. Glioblastoma rapidly integrated into neural circuits across the brain, engaging in widespread functional communication, with cholinergic neurons driving glioblastoma invasion. We uncovered patient-specific and tumor-cell-state-dependent differences in synaptogenic gene expression associated with neuron-tumor connectivity and subsequent invasiveness. Importantly, radiotherapy enhanced neuron-tumor connectivity by increased neuronal activity. In turn, simultaneous neuronal activity inhibition and radiotherapy showed increased therapeutic effects, indicative of a role for neuron-to-glioma synapses in contributing to therapeutic resistance. Lastly, rabies-mediated genetic ablation of tumor-connected neurons halted glioblastoma progression, offering a viral strategy to tackle glioblastoma. Together, this study provides a framework to comprehensively characterize neuron-tumor networks and target glioblastoma.

Glioblastomas are heterogeneous brain tumors, notorious for their invasive behavior and resistance to therapy. Neuron-to-glioma synapses have been identified to promote glioblastoma invasion and proliferation. However, a comprehensive characterization of tumor-connected neurons has been hampered by a lack of technologies. Here, we adapted retrograde tracing with a modified rabies virus system to characterize and manipulate connected neuron-tumor networks. Glioblastoma rapidly integrated into neural circuits across the brain engaging in widespread functional communication, with acetylcholinergic and glutamatergic neurons driving glioblastoma progression. We uncovered patient-specific and tumor cell state-dependent differences in synaptogenic gene expression driving neuron-tumor connectivity and subsequent invasivity. Importantly, radiotherapy enhanced neuron-tumor connectivity by increased neuronal activity. In turn, simultaneous inhibition of AMPA receptors and radiotherapy showed increased therapeutic effects, indicative of a role for neuron-to-glioma synapses in contributing to therapeutic resistance. Lastly, rabies-mediated genetic ablation of tumor-connected neurons halted glioblastoma progression, offering a novel viral strategy to target glioblastoma. Together, this study provides a comprehensive framework for basic research and clinical translation of synaptic neuron-cancer interactions to target glioblastoma.